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4月8日,某研究所将NMT技术应用于钙信号研究,测试样品为小麦,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。| 5月9号,某研究院将NMT技术应用于逆境生理领域,测试样品为黄瓜幼苗,测试指标为NO3-、NH4+,在旭月研究院完成实验。| 6月2号,某研究院将NMT技术应用于逆境胁迫领域,测试样品为棉花苗,测试指标为Ca2+、H+、K+、Na+、IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月5号,某研究院将NMT技术应用于植物逆境领域,测试样品为苜蓿,测试指标为K+,在旭月研究院完成实验。| 6月9号,某研究所将NMT技术应用于水稻逆境领域,测试样品为水稻,测试指标为Na+、Ca2+,在中国科学院植物研究所完成实验。| 6月11号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为酵母细胞,测试指标为IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月16号,某高校将NMT技术应用于昆虫研究,测试样品为昆虫,测试指标为Ca2+、K+,在旭月研究院完成实验。| 6月19号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为拟南芥,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。|

EEB海大江行玉组:NMT发现碱胁迫下cbl10突变体吸H+↓ 为证明CBL10通过促叶片泌H负调节H泵活性适应碱胁迫提供证据

 

 

 

 

 

基本信息

主题:NMT发现碱胁迫下cbl10突变体吸H+ 为证明CBL10通过促叶片泌H负调节H泵活性适应碱胁迫提供证据

期刊:Environmental and Experimental Botany

影响因子:5.545

研究使用平台NMT植物耐盐创新平台

标题:The calcium sensor CBL10 negatively regulates plasma membrane H+-ATPase activity and alkaline stress response in Arabidopsis

者:广东海洋大学、海南大学江行玉,海南大学周扬、谢青、杨莹

 

检测离子/分子指标

H+

 

检测样品

拟南芥叶片

 

中文摘要

      质膜(PM)H+-ATPase(AHA)为植物细胞内一些重要的生理生化过程提供能量,在植物生长发育中起关键作用。本研究发现拟南芥cbl10突变体在盐胁迫下的生长和PM H+-ATPase活性均低于野生型植株(WT),推测钙调磷酸酶B类似蛋白(calcineurin B-like protein 10, CBL10)可能参与AHA的调控。相反,当暴露在外部较高的pH值胁迫下时,cbl10的生长比WT好,而表达CBL10基因的cbl10植物在外部高pH值下的生长与WT相似。在碱性条件下,cbl10突变体的质子内流速率比WT低,cbl10突变体生长的平板区域pH低于WT平板低。酵母双杂交和BiFC实验表明,CBL10与AtAHA4或AtAHA11的C端结合,使得共表达CBL10和AHA4/AHA11的酵母细胞的生长比单个AHA4AHA11的转基因细胞差。这说明CBL10通过直接与AtAHA4或AtAHA11相互作用而负调控PM H+-ATPase活性,降低了拟南芥适应碱性环境的能力。总的来说,这项研究表明,CBL10可能作为一个相互连接的调节器,协调植物对盐碱胁迫的反应。

 

离子/分子流实验处理方法

在pH为8.1的MS培养基上生长12 h

 

离子/分子流实验结果

      为了验证cbl10突变体是否可以通过排出更多的质子来适应碱性环境,研究用非损伤微测技术(NMT)检测了cbl10突变体和野生型植物叶片的质子流速(图1)。测试液的酸化导致碱性培养基中植物的叶细胞有显著的质子吸收。cbl10突变体的质子内流速率显著低于野生型植株,表明在碱性胁迫下,cbl10突变体的H+跨质膜的速度可能快于野生型植株。

 

图1.碱胁迫下野生型和cb110拟南芥幼苗叶片H+的净流速正值代表离子外排,负值表示离子吸收

 

其他实验结果

  • 盐胁迫条件下CBL10正向调控拟南芥质膜H+-ATPase活性。为了证实盐胁迫下的质子泵活性,本研究从cbl10突变体和WT中纯化了质膜囊泡,并测定了盐胁迫下质膜H+-ATP酶的活性,cbl10突变植株的H+-ATPase活性显著低于野生型植株,表明CBL10可能通过增加质膜H+-ATPase的质子泵能力来间接调节质膜Na+/H+逆向转运蛋白的活性,并直接响应CIPK24/CIPK8介导质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1的作用。

  • cbl10突变植株对外界高pH条件具有耐受性。萌发试验结果表明,WT在pH为5.8的MS培养基上与cbl10突变生长相似,但在pH为7.7或pH为8.1的MS培养基上,WT幼苗生长较cbl10萌发后生长较慢;在正常条件下,野生型和cbl10突变植株的生长参数(根长和生物量)均无差异,然而在碱性平板上生长16天后,cbl10突变体的生长优于WT;cbl10突变植株表型的改变可能是由于CBL10缺失所致,与预期一致,在pH为7.7的培养基中,互补株系的表型几乎恢复到野生型水平;这些结果表明,CBL10负调控了拟南芥对外部高pH环境的响应。

  • cbl10突变植株在碱性环境下质子泵能力增强。可视化结果表明,与WT相比,cbl10突变体排出了更多H+到细胞外空间,导致了生长介质酸化;CBL10的表达可能损伤了质膜H+-ATPase介导的H+外排,即CBL10可能在碱性环境下负调控质膜H+-ATPase活性。

  • CBL10与质膜H+-ATPase之间的相互作用。酵母双杂交实验表明,共表达CBL10和cAHA4cAHA11的酵母细胞可以在选定的培养基中生长;利用BiFC技术在共转基因原生质体中检测CBL10-cAHA4和CBL10-cAHA11复合物的荧光信号;这些结果表明,在植物细胞中CBL10可以直接与AHA4或AHA11相互作用。

  • 在酵母中重组CBL10对AHA4AHA11的调控。与pMP1745-AHA4/AHA11和空载pMP1645在富葡萄糖培养基中转化的培养基相比,CBL10和AHA4/11共表达导致转基因酵母细胞的生长减弱。综上所述,CBL10通过与C端直接相互作用,负调控质膜H+-ATPase的功能。

 

结论

     本研究结果表明,CBL10在盐碱胁迫胁迫下参与了两条途径。然而,CBL10功能在这两种调节模式之间的切换仍有待进一步研究。

 

测试液

0.1mM CaCl2, 0.1mM KCl, 0.5 mM MES, pH 6.0

 

NMT试验标准化方案

盐胁迫研究NMT标准化方案

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

 

 

 

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0098847221003828?via%3Dihub

供稿:张强、赵雪琦
编辑:刘兆义

 

关键拟南芥;钙调磷酸酶B类似蛋白;H+-ATPase;碱胁迫;质膜;植物类