nd Crop Prod海南大学&广东海洋大学：NMT从Na+/K+/H+/Ca2+流角度为探究铁皮石斛CIPK24促耐盐旱机制提供证据

基本信息

nd Crop Prod海南大学&广东海洋大学：NMT从Na⁺/K⁺/H⁺/Ca²⁺流角度为探究铁皮石斛CIPK24促耐盐旱机制提供证据

期刊：Industrial Crops & Products

影响因子:6.449

研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台

标题：The Dendrobium catenatum DcCIPK24 increases drought and salt tolerance of transgenic Arabidopsis

作者：海南大学周扬、张婷婷、李雨欣；广东海洋大学江行玉

检测离子/分子指标

Ca²⁺、H⁺、Na⁺、K⁺流速

检测样品

拟南芥根

Ca²⁺：分生区

H⁺：成熟区

Na+、K⁺：伸长区

中文摘要

蛋白激酶CIPK在应对非生物胁迫中起着至关重要的作用。铁皮石斛因难以适应逆境而被列为我国珍稀濒危植物。然而，关于其对非生物胁迫反应的研究很少。本研究从铁皮石斛中克隆CIPK24基因。表达模式分析表明CIPK24表现出一定的组织特异性，在萼片和花瓣中表达水平较高；用PEG模拟干旱胁迫处理后，发现CIPK24在茎和叶中的表达会上调，而在盐胁迫处理后在根中的表达会上调。定位分析表明DcCIPK24定位于细胞核、质膜和细胞质。与野生型（WT）植物相比，DcCIPK24过表达增加了转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性。在干旱或盐胁迫下，转基因植物的丙二醛（MDA）含量较低，而脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性高于WT。此外，相比WT，在转基因植株中，干旱处理会诱导根出现更快的Ca²⁺和H⁺流入。经NaCl处理后，转基因根系的Na⁺外排更强，但K⁺外排速率低于WT根系，故转基因植物中Na⁺积累较少。RNA-seq分析表明，在干旱和盐胁迫下，分别在DcCIPK24转基因植物中发现了114个和497个差异表达基因(DEG)。KEGG分析发现：干旱胁迫下，DEGs在淀粉和蔗糖代谢、角质和蜡的生物合成和过氧化物酶体途径中富集；盐胁迫下，DEGs在苯丙烷生物合成途径和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中富集。这些发现表明，DcCIPK24 是铁皮石斛对干旱和盐胁迫响应的正调节因子，表明它在增强铁皮石斛干旱和耐盐性方面具有潜在应用。

离子/分子流实验处理

Ca²⁺、H⁺：7天苗，20% PEG8000瞬时处理

Na+：7天苗，100mM NaCl处理24小时

K+：7天苗，100mM NaCl 瞬时处理

离子/分子流实验结果

为了探究探讨干旱胁迫下Ca²⁺是否介导根系信号转导，研究用非损伤微测技术（NMT）检测了胁迫前后拟南芥根部净Ca²⁺通量的变化（图1）。结果表明，在正常条件下，野生型拟南芥和转基因拟南芥均表现出一定的Ca²⁺外排。在干旱胁迫下，转基因植株与野生型植株根部Ca²⁺通量方向和幅度存在显著差异。在干旱胁迫下，野生型植株的根部仍然表现出Ca²⁺外排，而OE-6和OE-12的根部，表现出Ca²⁺内流，净通量分别为−15.40和−21.88 pmol cm^-2s^-1。研究继续检测了转基因拟南芥和野生型拟南芥根部成熟区在干旱胁迫下的H⁺通量动力学。结果表明，PEG胁迫瞬时处理导致H⁺由显著外排向显著内流变化，表明PM H⁺-ATP酶活性的激活。在10 min试验中，两个转基因株系(OE6和OE12)的平均H+净通量分别为−8.74和−10.48 pmol cm^-2s^-1，分别比野生型拟南芥高145.20%和194.23%。

图1.干旱胁迫下野生型和转基因拟南芥根部Ca²⁺（分生区）和H⁺（成熟区）的瞬时通量变化。正值代表离子外排，负值表示离子吸收。

图2.盐胁迫下野生型和转基因拟南芥根部伸长根区Na⁺和K⁺瞬时通量的变化。正值代表离子外排，负值表示离子吸收。

其他实验结果

DcCIPK24的克隆及序列分析。采用PCR法克隆到该基因，全长1332 bp，编码443个氨基酸。系统发育分析表明，该序列与拟南芥CIPK蛋白中AtCIPK24最接近。因此，该基因被命名为DcCIPK24。DcCIPK24蛋白序列与拟南芥CIPK24(AtCIPK24)的同源性为72.65%，与水稻CIPK24(OsCIPK24)的同源性为72.19%。与其他CIPKs一致，DcCIPK24在C端有一个调控域，在N端有一个激酶域，带有一个CBL相互作用的NAF/FISL模块(图1b，C)。与其他CIPKs相似，DcCIPK24的激活环具有三个保守的氨基酸(S154、T166和Y173)作为其他蛋白激酶的潜在靶点。

DcCIPK24的亚细胞定位。跨膜结构域分析显示，DcCIPK24没有跨膜螺旋结构域，表明DcCIPK24可能是一种非膜蛋白。通过绿色荧光蛋白(GFP)与DcCIPK24融合，并转化拟南芥叶肉细胞原生质体，在共聚焦显微镜下观察发现DcCIPK24蛋白主要定位于细胞核和质膜上，部分定位于细胞质中。

DcCIPK24在铁皮石斛中的表达分析。空间表达结果表明，DcCIPK24的表达具有组织特异性。萼片和花瓣中表达量最高，与根相比变化量为17倍，其次是茎、唇、花茎和雌蕊，蒴果、茎和根中表达量变化最小。干旱胁迫下，茎、叶中DcCIPK24基因表达上调，而根中基因表达无显著变化。干旱处理48 h后，茎叶和叶片的表达量均达到峰值，分别增加了6倍和4倍。在盐胁迫下，DcCIPK24在根中表达上调，在处理24 h后达到峰值（比初始时间增加了6倍），而在茎和叶中没有显著变化。这些结果表明，DcCIPK24对盐胁迫和干旱胁迫有响应。

DcCIPK24的过表达赋予转基因拟南芥耐旱性和耐盐性。为了进一步研究DcCIPK24的功能，将DcCIPK24基因转化到拟南芥中。经Hyg B筛选，获得11株独立的抗性植株，并通过PCR扩增进行鉴定。筛选了两个DcCIPK24表达水平相对较高的转基因株系(OE6和OE12)进行进一步的表型分析。为了研究DcCIPK24的功能，研究采用5日龄的WT和DcCIPK24转基因(OE6和OE12)幼苗进行干旱和耐盐性分析。经过7d处理后发现干旱和盐胁迫下转基因株系的根系更长，而正常条件下转基因植株和WT植株的根长均无明显变化。而在15% PEG8000和150 mM氯化钠处理下，OE6和OE12植株的鲜重远高于野生型植株，表明DcCIPK24可以提高植株的干旱性和耐盐性。为了进一步分析DcCIPK24对干旱和盐胁迫的响应，将在1/2 MS培养基中培养8日龄的幼苗转移到土壤中生长1个月，然后诱导干旱或盐胁迫。经过干旱或盐胁迫处理后，植株叶片枯萎；在正常条件下，所有植株表现出相似的生长趋势。值得注意的是，WT植株比转基因植株(OE6和OE12)生长得更弱，并且在胁迫下表现出更多的枯生叶片。因此，经过干旱和盐胁迫处理后，OE6和OE12植株的鲜重远远高于野生型植株。

干旱和盐胁迫下DcCIPK24促进ROS稳态和渗透调节因子的积累。非生物胁迫影响ROS的稳态，导致ROS的积累，包括过氧化氢（过氧化氢）和丙二醛(MDA)。本研究分别用NBT和DAB染色检测干旱和盐胁迫下叶片过氧化氢和O₂^-的积累。在正常情况下，转基因植株和野生型植株的叶片均染色较浅且均匀，表明过氧化氢和O₂^-水平较低。干旱和盐胁迫下，WT和转基因植株叶片的染色颜色都较深，表明植株的O₂^-和过氧化氢含量均高于未处理植株。此外，在干旱和盐胁迫下，转基因植株的棕色深度均低于野生型植株，表明DcCIPK24可以缓解过氧化氢和O₂^-的积累。在正常条件下，所有植物的MDA含量相似。而在干旱和盐胁迫下，WT植株的MDA含量均高于转基因DcCIPK24的拟南芥。同时，在正常条件下，各组的SOD活性无显著差异，而在干旱和盐胁迫下显著升高；转基因株系的SOD活性高于野生型植株。此外，在干旱和盐胁迫下，转基因植株的脯氨酸含量显著高于WT植株，表明DcCIPK24通过积累渗透保护物质，增强了植物的干旱和盐胁迫抗性。

DcCIPK24转基因拟南芥的转录组分析。为了研究DcCIPK24调控拟南芥干旱和盐胁迫抗性的潜在机制，利用RNA-seq对干旱和盐胁迫下的差异表达基因进行了分析，在干旱和盐胁迫下分别发现了114个和497个DEGs。此外，干旱胁迫下，101个DEGs下调，13个DEGs上调；盐胁迫下，20个DEGs下调，477个DEGs上调。在干旱胁迫下，13个上调的DEGs在7条KEGG通路中富集，101个下调的DEGs在18条KEGG通路中富集。大多数DEGs与核糖体、戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化以及植物激素信号转导有关。特别是FAR3与过氧化物酶体相关，APL4与蔗糖和淀粉代谢相关，这两种基因在转基因植物中均上调。有趣的是，MAPK信号通路-植物被发现表达下调。通过RT-qPCR进一步验证了转录组数据中差异表达的一些过氧化物酶体、MAPK信号通路、淀粉和蔗糖代谢通路基因。转基因株系中FAR3和APL4在转基因株系中的表达水平显著高于野生型植株。相比之下，属于MAPK信号通路植株的PYL5在转基因株系中的表达水平显著低于WT植株。在盐胁迫下，497个DEGs富集在65条KEGG通路中。对显著的前20条通路进行深入分析，发现只有光合作用-触角蛋白途径包含有2个下调基因，其余的19条通路均包含的是上调基因。此外，MAPK信号通路、苯丙素生物合成和植物激素信号转导通路的富集量最多。与野生型植株相比，盐胁迫下OE6系中大多数基因均显著上调，如HAI3、MAPKKK18、ACS2和PER4。在这4个DEGs中，HAI3、MAPKKK18和ACS2在MAPK信号通路中富集，HAI3在植物激素信号转导通路中富集，PER4与苯丙素生物合成相关。RT-qPCR结果表明，在盐胁迫条件下，OE6细胞系中均表达上调，这与转录组数据一致。

结论

铁皮石斛DcCIPK24可以提高转基因拟南芥的耐盐性和耐旱性。研究发现，DcCIPK24主要通过清除ROS来响应干旱和盐胁迫。RNA-seq分析表明，干旱胁迫下，DcCIPK24通过上调过氧化物酶体、蔗糖和淀粉代谢通路相关基因，下调MAPK信号通路相关基因；盐胁迫下，DcCIPK24通过上调MAPK信号通路，苯丙素生物合成和植物激素信号转导通路相关基因发挥作用。本研究不仅为铁皮石斛抗性分子育种提供了候选基因，而且也为CIPK24的功能研究奠定了基础。

测试液

1、Ca²⁺、H⁺实验

1）PEG8000处理前：0.1 CaCl2，pH5.8

2）PEG8000瞬时处理后：0.1 CaCl2，20% PEG 8000，pH5.8

2、Na⁺外排实验

0.5 NaCl，pH5.8

3、K⁺外排实验

1）盐处理前：0.5 KCl，pH5.8

2）盐处理后：100 NaCl，0.5 KCl，pH5.8

盐胁迫NMT实验SOP

盐胁迫Na⁺、K⁺流实验体系

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2022.115375