ABA处理下保卫细胞Ca2+信号检测

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经典案例

Plant Cell巩志忠：NMT发现ABA促保卫细胞泌H+(胞质碱化)依赖于BAK1和AHA2 为AHA2参与干旱下ABA诱导气孔关闭提供证据

Mol Plant西农李积胜：NMT发现H2S介导SnRK2.6结构变化促保卫细胞吸钙诱导气孔关闭 为蛋白质翻译后修饰互作促植物抗旱提供证据

 

推荐实验设备

Physiolyzer^® （NMT300-PYZ-XY)

 

实验意义

检测ABA处理下的Ca²⁺实时跨膜吸收（内流）速率

 

检测指标

Ca²⁺

 

样品培养及处理

苗龄

苗龄无强制要求。该实验使用苗期样品较多，常见样品苗龄参考：

苗龄无强制要求，根据您的研究需求即可。该实验使用苗期样品较多。

 

培养方式

水培、琼脂培养基、土培、沙培均可。

 

样品选取

1.植株选取

选取状态良好且外观形态在组内占主流的植株。

2.叶片选取

1）根据您的研究需求，选择植株上特定位置的叶片，例如从下往上数的第x片叶片。部分研究可能无此要求，同一研究的叶片选取标准需保持一致。

2）同一组内，叶龄、叶片颜色、大小尽量一致

3）优先完整无损伤的叶片

 

检测流程

前处理

1.将处理后的叶片连带叶柄完整取下，如叶片较大，则在叶片上剪取1cm*2cm的叶片组织，浸泡在缓冲溶液（1.0 mM MES, pH6.15）中，20000勒克斯光照90分钟。

2. 按照视频教程，揭去叶片下表皮，将透明的叶片下表皮内侧朝上，粘在35mm培养皿底部的双面胶上。

3. 加入4mL测试液静置10分钟，该过程持续给予20000勒克斯光照。

 

样品前处理视频

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检测过程

1.在载物台旁边放置光源，且持续给予培养皿中的下表皮组织20000勒克斯光照。

2. 选取外观完整且气孔处于较充分打开状态的保卫细胞。先检测ABA处理前的信号，再瞬时加入1mL ABA处理液母液（5× ABA, 0.2 mM CaCl₂, 1.0 mM MES, pH6.15）后，检测处理后信号。ABA处理液母液中的ABA浓度，为ABA处理终浓度的5倍。该实验常用ABA终浓度为10~50  μM。

3.检测位点：保卫细胞表面

4.检测时长：ABA处理前5分钟， ABA处理后10-20分钟

5.重复数：n≥10，即每组检测不少于10个保卫细胞。如同一株样品有多片叶片符合检测要求，可在同一株上取不止1片叶片，也可在同一片叶片上取不止1块下表皮组织，还可在同一块下表皮组织上测不止1个保卫细胞。一组实验使用的植株数不可少于3株。

 

耗材清单

测试液：10 mM KCl, 0.2 mM CaCl₂, 1.0 mM MES, pH6.15

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检测参数

1.物镜倍数：20倍

2.采样规则：Z-10

3.传感器--样品表面距离：2μm

 

参考文献

1. 许越.非损伤微测技术—2022[J].NMT通讯,2023(01):3-9.DOI:10.5281/zenodo.8227586.

2. Yang M, He J, Sun Z, et al. Drought priming mechanisms in wheat elucidated by in-situ determination of dynamic stomatal behavior. Front Plant Sci. 2023 Feb 17;14:1138494. DOI: 10.3389/fpls.2023.1138494.

3. Chen S, Wang X, Jia H, et al.Persulfidation-induced structural change in SnRK2.6 establishes intramolecular interaction between phosphorylation and persulfidation. Mol Plant. 2021 Jul 6:S1674-2052(21)00268-9. DOI: 10.1016/j.molp.2021.07.002.

4.Pei D, Hua D, Deng J, et al. Phosphorylation of the plasma membrane H⁺-ATPase AHA2 by BAK1 is required for ABA-induced stomatal closure in Arabidopsis. Plant Cell. 2022 Apr 11:koac106. doi: 10.1093/plcell/koac106.