干旱胁迫下植物叶肉Ca2+信号检测

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经典案例

Plant Biotechnol J 浙大陈仲华、邬飞波：HvAKT2和HvHAK1通过增强叶肉H⁺稳态提升耐旱能力

 

推荐实验设备

Physiolyzer^® （NMT300-PYZ-XY)

 

实验意义

检测干旱胁迫下的Ca²⁺实时跨膜吸收（内流）速率

 

检测指标

Ca²⁺

 

样品培养及处理

苗龄

苗龄无强制要求。该实验使用苗期样品较多，常见样品苗龄参考：

拟南芥：1~4周

水稻：1~5周

烟草：1~3周

杨树：4~7周

棉花：1~4周

 

培养方式

水培、琼脂培养基、土培、沙培均可。

 

样品选取

1.植株选取

选取状态良好且外观形态在组内占主流的植株。

2.叶片选取

1）根据您的研究需求，选择植株上特定位置的叶片，例如从下往上数的第x片叶片。部分研究可能无此要求，同一研究的叶片选取标准需保持一致。

2）同一组内，叶龄、叶片颜色、大小尽量一致

3）优先完整无损伤的叶片

 

检测流程

前处理

1.从目标叶片上剪取1cm*1cm的叶片组织，揭去叶片组织的下表皮，暴露叶肉组织。如果叶片面积较小，直接用整片叶片。

叶片暴露叶肉组织

2.对折叶片，叶片下表面朝外，让暴露出叶肉组织处于外侧弯折面处，使用铝箔条将远离弯曲面的叶片组织条尾部夹住，使用样品固定专用树脂块将样品压在培养皿底部，露出叶片弯折处的叶肉组织。

叶肉细胞样品固定

 

3.加入测试液浸没叶片，静置2小时，不同规格的培养皿对应加入测试液体积：

35/60/90 mm培养皿，分别对应4/10/40 mL测试液。

 

样品前处理视频

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检测过程

1.先检测PEG处理前的信号，再瞬时加入1mL PEG处理液母液（5xPEG, 1.0 mM NaCl, 0.1 mM KCl, 0.2mM CaCl₂, 0.2 mM MES, pH5.8）后检测处理后信号。PEG处理液母液中的PEG浓度，为PEG处理终浓度的5倍。该实验常用PEG终浓度为10~20%。

2.检测位点：叶肉细胞表面。

3.检测时长：PEG处理前5分钟，PEG处理后10-20分钟。

4.重复数：n≥8，即每组检测不少于8块叶片组织。如同一株样品有多片叶片符合检测要求，可在同一株上取不止1片叶片，也可在同一片叶片上取不止1块叶片组织，一组实验使用的植株数不可少于3株。

 

耗材清单

测试液：1.0 mM NaCl, 0.1 mM KCl, 0.2mM CaCl₂, 0.2 mM MES, pH5.8

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检测参数

1.物镜倍数：4倍

2.采样规则：X-30

3.传感器--样品表面距离：5μm

 

参考文献

1.许越.非损伤微测技术—2022[J].NMT通讯,2023(01):3-9.DOI:10.5281/zenodo.8227586.

2.Li B, Zhang M, Sun W, et al. N6-methyladenosine RNA modification regulates cotton drought response in a Ca²⁺ and ABA-dependent manner. Plant Biotechnol J. 2023 Mar 22. doi: 10.1111/pbi.14036.

3.Feng X, Liu W, Qiu C, et al. HvAKT2 and HvHAK1 confer drought tolerance in barley through enhanced leaf mesophyll H⁺ homoeostasis. Plant Biotechnol J. 2020 Aug;18(8):1683-1696. doi: 10.1111/pbi.13332.