北京林大陈少良：REM6.5 激活质膜质子泵促植物耐盐|NMT植物耐盐创新平台
NMT作为生命科学底层核心技术，是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年，NMT已扎根中国15年。2020年，中国NMT销往瑞士苏黎世大学，正式打开欧洲市场
基本信息
主题：REM6.5 激活质膜质子泵促植物耐盐
期刊：Tree Physiology
影响因子：3.477
研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台
标题：Populus euphratica remorin 6.5 activates plasma membrane H+-ATPases to mediate salt tolerance
作者：北京林业大学陈少良、张会龙
检测离子/分子指标
Na+，H+，K+
检测样品
7日龄拟南芥（WT和转基因）根分生区（距根尖200µm根表上的点）
中文摘要（谷歌机翻）
Remorins（REM）在植物适应不利环境的能力中起着重要作用。PeREM6.5是胡杨，耐盐杨树中REM家族的一种蛋白质，是由愈伤组织，根和叶中的NaCl胁迫诱导的。我们从胡杨假单胞菌中克隆了全长PeREM6.5，并将其转化为大肠杆菌和拟南芥。PeREM6.5重组蛋白显着提高了胡杨质膜（PM）囊泡中的H ATPase水解活性和H+转运活性。酵母杂交分析表明，胡杨REM6.5与RPM1相互作用蛋白4（PeRIN4）相互作用。PeRI N4重组蛋白增强了PeREM6.5诱导的PM H+ -ATPase活性的增加，在拟南芥中PeREM6.5的正向表达在存活率，根生长，电解质渗漏和丙二醛含量方面显着提高了转基因植物的耐盐性。过表达PeREM6.5的拟南芥植物在体内和体外试验中均保持较高的PM H+ -ATPase活性。由于H+ -ATPases促进了Na的挤出，PeREM6.5转基因植物的Na积累减少，而且H+泵引起了血浆膜的每极化，降低了盐碱化根系PM中去极化激活通道介导的K+损失，因此，我们得出以下结论：帽子PeREM6.5调节了PM中的H+ -ATPase活性，从而增强了植物在盐度下保持离子稳态的能力。
离子/分子流实验处理方法
（1）125 mM NaCl处理12小时
（2）500 μM钒酸钠处理20分钟
离子/分子流实验结果
使用NMT技术，在低Na+测试液中记录了来自对照和盐处理植物根部的Na+外排。NaCl处理（12 h）导致所有测试株系的Na+外排显著增加（图1A）。转基因植物在NaCl处理后表现出比WT植物更高的Na+外排（图1A）。在所有测试株系中，NaCl均增加了K+的外排，但WT中的K+损失高于转基因植物（图1B）。
图1
在NaCl处理下，H+由内流转为外排，转基因植物中的H+外排显着高于野生型植物（图2A）。但是，盐诱导的H+外排被质膜（PM）H+-ATPase的特异性抑制剂钒酸钠消除（图2A）。该结果表明盐诱导的H+外排是由H+泵活性增加引起的。H+外排在转基因植物中更为明显的事实表明，转基因植物在NaCl胁迫下仍具有较高的H+泵活性。
PeREM6.5-转基因植物的根在盐胁迫下表现出比野生型植物的根更高的PM超极化（-63±2 mV），尽管在无对照植物中膜电位相似（-82±3 mV；图2B）。膜电位越负，说明PM中的H+泵活性越高。
对PeREM6.5-转基因拟南芥中分离的PM囊泡进行了PM H+-ATPase活性的体外测定。与野生型相比，转基因植物通常表现出更高的ATP水解活性（2.1倍；图2C）。因此，PeREM6.5上调了转基因株系中PM H+-ATPase的活性。这一发现与转基因拟南芥根系中H+转运活性增加的体内协调一致（图2A）。综上所述，PeREM6.5可以提高转基因拟南芥中PM H+-ATPase的活性。
图2
其他实验结果
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无论NaCl浓度如何，胡杨PeREM6.5在愈伤组织、根和地上部分均对NaCl胁迫有响应。
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从胡杨叶中克隆了PeREM6.5的cDNA全长1130bp。PeREM6.5氨基酸序列与populus trichocarpa（PtREM）的相似性高。结构分析预测PeREM6.5蛋白质是典型的Remorin-C结构域。
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共聚焦激光扫描显微镜结果表明，PeREM定位于PM和细胞质。此外，PeREM6.5与PM标记FM4-64部分共定位，表明PeREM6.5是与PM相关的蛋白质。
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PeREM6.5与PeRIN4相互作用，提高胡杨PM H+-ATPase的酶活性。
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半定量逆转录PCR和RT-qPCR显示，OE2、OE15和OE21表达的PeREM6.5转录水平高于其他株系。
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PeREM6.5过表达提高了拟南芥的耐盐性。
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盐处理（12h）显著增加了所有试验株系的根细胞内Na+浓度。然而，转基因株系中的Na+特异性荧光低于野生型。与盐渍化根相比，在对照条件下荧光强度几乎无法检测。
结论
基于我们的研究结果，我们得出结论：PeREM6.5介导了胡杨的H+泵活性。盐处理诱导了胡杨中REM6.5的表达，编码蛋白与PeRIN4相互作用，稳定了H+-ATPase复合物，从而提高了PM H+-ATPase的活性。因此，PeREM6.5-PeRIN4-蛋白复合物激活的H+-泵通过Ca2+-SOS途径促进Na+/H+反转运。此外，活化的PM H+-ATPase保留较少的去极化PM，限制K+通过DA-KORC和DA-NSCC外排。结果表明，盐碱环境下胡杨属植物保持了K+/Na+的动态平衡。
离子流实验使用的测试液
0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8
文章原文：https://academic.oup.com/treephys/article-abstract/40/6/731/5775609
2019版《NMT论文集》已出版
关键词：杨树，盐，remorin，H+ -ATPase，RIN4质膜囊泡，H通量，Na通量