《NMT 通讯》第四期
8
收稿日期：
2023-3-9
编辑作者
E-mail:yanhan@nmtia.org.cn
PBJ 兰大万东石：NMT 发现盐胁迫 OSIC1 正调控根排 Na
+
速率 为
揭示其调控渗透胁迫诱导气孔关闭的机制提供证据
一、基本信息
研究使用平台：
NMT
盐碱胁迫创新平台
期刊：
Plant Biotechnology Journal
主题：
NMT
发现
C
2
H
2
-ZFP
转录因子编码基
因
OSIC1
在胁迫诱导气孔关闭中的相关机
制
标 题：
The C
2
H
2
-type zinc nger transcription
factor OSIC1 positively regulates stomatal
closure under osmotic stress in poplar
影响因子：
13.263
作者：兰州大学万东石，白秋仙，牛智敏，
四川大学姜渊忠
二、检测离子 / 分子指标
Na
+
三、样品信息
新疆杨根（距根尖顶点
300 μm
根表上
的点）
四、中文摘要
盐和干旱会损害植物的渗透稳态，并
极大地限制植物的生长和发育植物减少气孔
开度以减少水分损失并保持渗透稳态，导致
提高应激耐受性。此研究确定了新疆杨中
被盐、干旱、聚乙二醇
6000
（
PEG6000
）
和脱落酸（
ABA
）诱导的
C
2
H
2
转录因子
基因
OSMOTIC STRESS INDUCED C
2
H
2
1
（
OSIC1
）。
OSIC1
过表达转基因杨树通过
减少气孔孔径来对高盐、干旱和
PEG6000
处理具有更强的耐受性，而由
CRISPR/
Cas9
系统介导产生的突变体表现出相反的
表型。此外，
OSIC1
在体外和体内直接上调
NMT 文献速递
《NMT 通讯》第四期
9
PalCuAOζ
（编码含铜多胺氧化酶）的表达，
以增强
H
2
O
2
在保卫细胞中的积累，从而在
胁迫时调节气孔关闭发生。此外，
ABA
、干
旱和盐诱导的
PalMPK3
磷酸化
OSIC1
增加
其对
PalCuAOζ
的转录活性。在转录和蛋白
质水平上，
OSIC1
的这一调控保证杨树气孔
快速关闭来对渗透压力做出反应。研究结果
揭示了一种由
OSIC1-PalCuAOζ
介导的保卫
细胞中
H
2
O
2
产生的新的转录调控机制。这
些发现加深了研究者对像杨树一样的多年生
木本植物在应对盐和干旱引起的渗透胁迫做
出反应时的了解，并提供育种的潜力目标。
五、离子 / 分子流实验处理方法
100 mM NaCl
瞬时处理
4
周龄新疆杨幼苗根
尖
30 min
图
1
.
OSIC1
基因参与维持新疆杨根中
Na
+
平衡。正值代表
Na
+
外排，负值代表
Na
+
内流。
NMT 文献速递
六、离子 / 分子流实验结果
通过非损伤微测技术（
NMT
）检测根
系
Na
+
流速发现，在盐胁迫下，植物会通过
重建离子稳态来维持细胞的正常代谢，减轻
盐胁迫造成的伤害。为了探究
OSIC1
是否
参与了离子稳态的重建，作者检测了
WT
、
OSIC1-OE
和
osic1-ko
新疆杨根尖在
100
mM NaCl
瞬时刺激下的
Na
+
外排情况。正
常条件下，
WT
、
OSIC1-OE
和
osic1-ko
杨
树根系
Na
+
通量在
±200 pmolcm
-2
s
-1
之间稳
定波动，将其作为对照组（图
1A
）。与对
照组相比，
NMT
实验分析表明盐处理导致
这些杨树根系
Na
+
通量的增加，但
OSIC1-
OE
中
Na
+
的外排变化最大，
WT
次之，而
osic1-ko
中的
Na
+
外排变化最小（图
1B
），
表明
OSIC1-OE
可以通过向外排更多的
Na
+
来提高根部对盐胁迫的耐受性。
《NMT 通讯》第四期
10
●
在盐、干旱和
ABA
处理下，
OSIC1
促进
了保卫细胞中
H
2
O
2
的积累
保卫细胞中
H
2
O
2
的积累对气孔关闭至
关重要。作者使用
H
2
O
2
敏感的荧光染料检
测了正常条件以及盐、
PEG6000
( 模拟干旱 )
和
ABA
处理下的保卫细胞中内源性
H
2
O
2
含
量。在正常条件下，
OSIC1-OE
株系的荧光
强度最高。经过盐、
PEG6000
( 模拟干旱 )
和
ABA
处理后，过表达系的荧光强度明显
增加，
WT
次之，
OSIC1- ko
系的荧光强度
最弱(图
6
)。因此，
OSIC1
正向调控胁迫
诱导的保卫细胞中
H
2
O
2
积累，来参与
ABA
信号传导。
●
OSIC1
靶定在
PalCuAOζ
的启动子上
为了确定
OSIC1
异位表达对杨树基因
的影响，作者使用野生杨树、盐胁迫的野
生杨树和非胁迫的
OSIC1-OE
杨树株系进行
了
RNA-seq
分析。作者从异位表达
OSIC1
株系和盐胁迫野生杨树中均上调了的
584
个
DEGs
中发现了催化底物产生
H
2
O
2
的铜
胺氧化酶基因
PalCuAOζ
，推测其可能是导
致
H
2
O
2
积累的
OSIC1
转录因子的靶点。
随后，作者通过酵母单杂交（
Y1H
）和凝
胶迁移率实验（
EMSA
）技术证实
OSIC1
通过结合
PalCuAOζ
启动子上的
OBE1
和
OBE3
结合元件，直接激活
PalCuAOζ
的表
达（图
7
）。因此，作者认为
PalCuAOζ
介
导
OSIC1
增加保卫细胞中
H
2
O
2
含量。为
了确定这一点，作者通过
CRISPR-Cas9
系
统分别在
WT
（
pacuaoζ-ko
）和
OSIC1-OE
杨树株系（
pacuaoζ-ko/OSIC1-OE
）下生成
了
PalCuAOζ
敲除杨树。与
WT
相比，即使
不使用
ABA
，
palcuaoζ-ko
和
palcuaoζ-ko/
OSIC1-OE
杨树的气孔宽度和面积都有所增
NMT 文献速递
七、其它实验结果
● OSIC1
正调控杨树盐胁迫的耐受性
作者通过农杆菌介导的杨树遗传转化
体系，获得
OSIC1
过量表达（
OSIC1-OE
）
和
CRISPR-Cas9
敲低（
osic1-ko
）的转基因
新疆杨。正常生长条件下，与野生型新疆杨
（
WT
）和
osic1-ko
株系相比，
OSIC1-OE
株
系表现出多分枝多根系（图
2
），且在盐处
理下，
osic1-ko
株系的盐胁迫耐受性受到极
大损伤，而
OSIC1-OE
株系则表现出更强的
盐耐受能力。因此，
OSIC1-OE
是杨树盐害
耐受性的正调控基因。进一步发现，在盐胁
迫下，
OSIC1
在气孔关闭中起积极作用（图
3
）。
● OSIC1
正调控杨树干旱胁迫的耐受性
此外，作者还追踪了干旱处理后杨树的
表型、气孔导度、叶片蒸腾和净光合速率等
气孔相关参数。结果表明，在干旱胁迫下，
OSIC1
通过正向调控气孔关闭来响应干旱胁
迫（图
4
）。
●
OSIC1
正调控
ABA
介导的气孔关闭
由于
ABA
诱导的
OSIC1
调控盐胁迫和
干旱胁迫下的气孔关闭，作者提出
OSIC1
诱导气孔关闭与
ABA
信号通路有关。为了
证明这一假设，作者对
ABA
处理的
OSIC1-
OE
、
osic1-ko
和
WT
杨树的气孔孔径进行了
观察和测量。当叶片浸泡在开放溶液 (
O
S)
中，气孔的长度、宽度和面积没有显著差异。
但在
ABA
处理
1.5 h
后，过表达叶片的气孔
宽度和面积减小最大，
3 h
后进一步减小，
且突变体叶片的气孔面积最大 ( 图
5
)。这
些结果表明，
OSIC1
在
ABA
介导的气孔关
闭中发挥了积极作用。
《NMT 通讯》第四期
11
图
2.
OSIC1-OE
和
osic1-ko
杨树的生长状态
图
3. OSIC1
正调控杨树对盐胁迫的耐受性
《NMT 通讯》第四期
12
图
4. OSIC1
正调控杨树对干旱胁迫的耐受性
图
5.
OSIC1
促进
ABA
诱导的气孔关闭
《NMT 通讯》第四期
13
图
6.
不同处理下保卫细胞中
H
2
O
2
含量检测
加。此外，
ABA
处理后气孔宽度和面积的
减小幅度显著小于
WT
。这说明
OSIC1
通过
调节
PalCuAOζ
的表达来调控
ABA
诱导的
气孔关闭。此外，作者还检测了突变体杨树
保护细胞中
H
2
O
2
的含量。敲除
PalCuAOζ
后，
即使提供
ABA
，
H
2
O
2
含量也明显下降，过
表达
OSIC1
也无法恢复 ( 图
8
)。因此，诱
导的
H
2
O
2
的
PalCuAOζ
是
OSIC1
调控气孔
关闭的必要条件，且
PalCuAOζ
是
OSIC1
的
遗传上位。
●
磷酸化
OSIC1
可增强其转录激活活性
为了进一步阐明
OSIC1
的转录调控机
制，通过酵母双杂交
(Y2H)
筛库鉴定
OSIC1
的相互作用蛋白。在候选蛋白中，作者发现
了拟南芥丝裂原激活蛋白激酶
(MPK3)
的同
源物，因此被命名为
PalMPK3
。点对点酵
母双杂试验（
Y2H
）和免疫共沉淀试验
(Co-
IP)
进一步确定了
OSIC1
和
PalMPK3
之 间
的相互作用。此外，磷酸化试验结果表明，
PalMPK3
在体外和体内均能磷酸化
OSIC1
（图
9
）。为了研究磷酸化的
OSIC1
对其
转录活性的影响，作者使用双荧光素酶实验
（
LUC
）证明磷酸化可以增强
OSIC1
的转
录激活活性。此外，另一项
LUC
实验表明，
共表达
PalMPK3
和
PalMKK5
DD
的
OSIC1
确
实显著增加了
LUC
强度；且随着
NaCl
浓度
的增加，
LUC
强度进一步升高（图
10
）。
这些结果表明，
OSIC1
具有其他的磷酸化位
点，这些位点被其他盐胁迫诱导的蛋白激酶
磷酸化。
《NMT 通讯》第四期
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图
7. OSIC1
通过结合到
PalCuAOζ
启动子的顺式作用元件上直接调控其表达
图
8. OSIC1
依赖
PalCuAOζ
介导气孔关闭和保卫细胞中
H
2
O
2
的积累
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八、结论
总之，该论文报道了杨树
C
2
H
2
-ZFP
转
录因子编码基因
OSIC1
在胁迫诱导气孔关
闭中的生物功能。首先，
OSIC1
主要在叶片
和木质部表达，且受盐、干旱、
PEG6000
和
ABA
诱导显著；第二，在转基因杨树中，
OSIC1
在杨树耐盐和干旱胁迫中发挥积极
作用，并引起全面的转录组重排；第三，
图
9.PalMPK3
在体内或体外与
OSIC1
相互作用，并使其磷酸化
图
10.PalMPK3
在体内或体外与
OSIC1
相互作用，并使其磷酸化
OSIC1
通过上调
PalCuAOζ
的表达加速
H
2
O
2
积累，导致气孔关闭。最后，
OSIC1
可以
被
PalMPK3
磷酸化以增强其转录活性。因
此，作者提出了一种新的杨树对渗透胁迫响
应的工作模型：正常情况下，
PalMPK3
和
OSIC1
的
mRNA
丰度维持在较低水平，其
编码产物失活；因此，
PalCuAOζ
的转录没
有被大量激活。因此，
H
2
O
2
含量不足以促
《NMT 通讯》第四期
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使气孔关闭。当杨树遭受到盐或干旱造成
的渗透胁迫时，
ABA
会积累。积累的
ABA
诱导
PalMPK3
和
OSIC1
的表达，并激活
PalMKK4/5
，进一步磷酸化
PalMPK3
。随
后，
OSIC1
被激活的
PalMPK3
磷酸化。磷
酸化的
OSIC1
结合到
PalCuAOζ
的启动子
上并上调其表达。
PalCuAOζ
催化生成更多
H
2
O
2
，从而介导气孔关闭，减少水分流失（图
11
）。这些研究成果不仅加深了木本植物对
渗透胁迫响应调控机制的理解，也为逆境胁
迫下杨树种质的筛选和培育提供了新思路和
理论依据。
九、测试液
0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl
2
, 0.1 mM MgCl
2
·6
H
2
O, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES , 0.2 mM
Na
2
SO
4
, pH=6.5
关键词：
OSIC1
；
C
2
H
2
；
ABA
；干旱胁迫；
盐胁迫；新疆杨；气孔；植物类
文献信息：
Qiuxian Bai, et al. The C2H2-type
zinc nger transcription factor OSIC1 positively
regulates stomatal closure under osmotic stress
in poplar. PLANT BIOTECHNOL J. doi:
10.1111/pbi.14007
图 11. 在盐和干旱胁迫下
OSIC1
调控气孔关闭的工作模型
（责任编辑：李雪霏）
