《NMT 通讯》第二期

张满仓

河南大学作物逆境适应与改良国家重点实验室，475000

摘要：

非损伤微测是电生理研究的一项重要技术，可通过无损的方式获取样品的实时生理生

态信息，对于研究生命活动规律及环境影响具有重要的生物学意义。本人在学习非损伤技术

后进行了许多相关实验，检测了多种样品，有一些自己的经验和理解，恰逢旭月公司举办了

非损伤微测技术应用高级研修班，邀请了多位名师讲解非损伤技术的应用。因此本文简单介

绍了非损伤微测技术及其在中国的发展，在研修班当中的学习心得以及自己在非损伤实验中

的个人经验。

关键词：

非损伤 , 电生理 , 植物逆境

一、非损伤微测技术简介及在中国发

展历程

非损伤微测技术（

Non-invasive Micro-

test Technology

，

NMT

）于

1974

年由美国

伍兹霍尔海洋生物学实验室的神经科学家

Lionel F. Jae

提出，非损伤微测技术是由扫

描离子选择性传感器技术（

SIET

）、微传

感器离子流技术（

MIFE

）、自参比极谱传

感器技术（

SERP

）、扫描极谱传感器技术

（

SPET

）扫描振动传感器技术（

SVET

）、

自参比离子选择性传感器技术（

SERIS

）等

技术共同组成的。它是一种研究活体材料生

理功能的技术，可在不损伤样品的前提下检

测分子 / 离子进出生物活体的流速（流动速

率和方向），单位是

pmol·cm

-2

·s

-1

，称为流

速（

Flux

）。是一种超高灵敏度的非接触方

式。因其活体检测、非损伤性、高分辨率和

动态实时等特点，常用于探索其它技术难以

非损伤高级研修班学习心得及个人经验总结

测得的生理特征，是目前生理功能研究的最

佳工具之一，并已广泛运用于医学、植物学、

动物学、微生物学、农业科学、药物学、环

境科学等领域。同时，NMT 还是动态分离子

组学（

imOmics

）的技术基础。在历经多年

的发展后，现已成为一项成熟的实验体系。

在国际顶尖杂志《

Science

》、《

Nature

》、

《

PNAS

》、《

Plant Cell

》、《

Environmental

Science & Technology

》等发表了大量相关科

研成果。非损伤微测技术的活体、动态和实

时的测量方式，以及高分辨率和高灵敏度，

帮助人类进行生理功能领域的研究，并在多

个学科中均有应用。

NMT

技术在中国已有多年发展，自

2001

年许越先生在美国萨诸塞洲创立美国

杨格公司起，

NMT

开始步入商业化阶段。

收稿日期：

2022-12-04

通讯作者：龙雨

E-mail:ly11385@hotmail.com

编辑作者

E-mail: yanhan@nmtia.org.cn

高级研修班结业心得

《NMT 通讯》第二期

2005

年旭月 ( 北京 ) 科技有限公司在北京

中关村成立，由中科院植物所匡廷云院士、

中科院生物物理所杨福愉院士、北京大学林

克椿教授组成学术专家顾问组，并与美国扬

格公司成为战略合作伙伴，NMT 正式进入中

国。

2014

年，“第二届非损伤微测技术研讨会”

在北京召开，成立“

NMT

国际标准化委员

会”。

2015

年，旭月 ( 北京 ) 生物功能研

究院在北京成立。

2015

年，由旭月 ( 北京 )

生物功能研究院成立了“中关村非损伤微测

技术产业联盟”。联盟致力于

NMT

的产业

化发展，目前已有二十多家科研院校及企业

加盟。

二、研修班学习心得

研修班多位老师分享了自己 NMT 相关的实验

研究，令我受益匪浅，以下分享我自己的学

习心得：

卓仁英教授主要讲授了伴矿景天镉富集

关键基因筛选与功能分析。实验使用酵母转

化体系筛选了

个与重金属镉耐受相关的

基因。预测这些基因可能参与 MAPKs 介导的

信号转导、钙离子信号、活性氧信号和激素

信号。其中的

SaHsfA4ch

基因可以提高酵

母菌株△

ycf1

的镉离子耐受性。使用非损

伤微测检测到过表达

SaHsfA4ch

与对照相

比，镉离子内流增大，促进了植物对镉离子

的吸收，增强拟南芥镉离子耐受性，提高了

活性氧清除酶的活性。

SaHsfA4ch

基因主要

在维管组织、花和茎中表达，且在镉胁迫下

有显著诱导。之后找到

SaHsfA4ch

基因调

控的三个下游基因：

SpPDR12

、

SpPCS2

和

SpHsfA4c

。通过

EMSA

和

LUC

活性检测发

现

SaHsfA4ch

可结合在

SpAPX2

基因启动子

的

HSE

元件上。

SaHsfA4ch

基因显著提高

了转基因东南景天的镉耐受性。卓教授的研

究找到了景天当中的镉离子耐受基因，研究

了其主要功能作用，并结合实际运用到了重

金属防治，是一项十分有意义的工作。

孙健教授主要讲解了碳点调控甘薯抗逆

性的分子机制。碳点具有促进电子传递、光

合作用和

ROS

清除的能力。实验利用丹参

粉合成的碳点可以诱导甘薯根细胞膜超极化

和不依赖于

ROS

的钙离子内流，并且在拟

南芥、烟草、水稻等多种作物中有相同的效

果。研究发现碳点诱导钙离子内流是通过表

面的羟基和羧基官能基团。碳点引起根细胞

钾离子和铵离子内流增加证明碳点激活了超

极化的非选择阳离子通道，推测为环化核苷

酸通道。然后检测到碳点有提高甘薯根细胞

cAMP

和

cGMP

含量。之后在拟南芥中发现

CNGC2/4/19/20

介导碳点诱导的拟南芥根细

胞钙离子内流和细胞质钙离子增加。碳点诱

导拟南芥钙离子内流依赖于凝集素受体激酶

LORE

和

LERCK-1.8

。将碳点施加在水培幼

苗可以增强盐胁迫下甘薯根细胞钙离子和钠

离子外流。碳点提高盐胁迫下拟南芥根钠离

子外流依赖于

CNGC2

。碳点可以抑制钠离

子吸收并降低根成熟区细胞和整株水平钠离

子积累。碳点提高根钙离子信号相关基因表

达和甘薯营养胁迫耐受性。孙老师研究了纳

米材料在甘薯抗逆中的作用，纳米技术作为

新兴技术具有很好的发展前景，研究中使用

NMT 检测了甘薯在施加碳点后的离子流速，

获得了直观清晰的实验数据，可以很好地反

高级研修班结业心得

《NMT 通讯》第二期

应处理效果。研究内容比较深入，找到了碳

点的官能基团和作用通道，对甘薯抗逆研究

具有重要作用。

张金林教授主要研究

NMT

在禾本科牧

草耐盐机制研究和耐盐种质筛选中的应用。

研究发现四翅滨藜茎和叶表面密布的盐囊泡

对抗盐和抗旱性有重要作用。选取多种植物

检测其土壤中钠钾离子比例，发现大面积碱

茅钠钾比最高。通过比较碱茅与小麦，发现

小麦钠离子含量显著高于碱茅，而钾离子含

量显著低于碱茅。这说明碱茅大量吸收了钾

离子，而减少了钠离子的吸收。使用洗液实

验测定了叶片表面分泌盐分的量，发现泌盐

不是碱茅耐盐性的主要原因。之后使用同位

素标记法发现碱茅根系钠离子内流速率低于

小麦。在钾离子饥饿，高浓度钠离子情况下

钠离子外排，氢离子外排降低。表明钠氢反

向转运蛋白消耗了更多的氢。接着研究了钠

离子转运相关基因，发现在钾饥饿情况下，

AKT1

基因表达量较高，参与了高亲和性钾

离子的吸收；在高盐和钾饥饿的情况下，

HKT1:4

和

HKT1:5

在木质部薄壁细胞中表

达，通过共质体途径排出钠离子。张老师研

究了耐盐植物碱茅的耐盐机理并寻找到钠离

子转运的相关基因，研究了它们在钠离子转

运中的功能，植物耐盐性作为植物逆境生存

的重要功能具有重要的研究意义，可以有效

改善植物在高盐碱地难以存活的状况。

三、非损伤个人经验及实验方案设置

我在使用非损伤系统进行实验过程逐渐

领略到了这项技术的便捷，可以快速测定样

品的离子流速，同时也有一些个人经验如下

溶液配置需要精准。测试液，校准

液，灌充液在实验过程中都具有非常重要的

作用，而测试液和校准液的离子浓度都很低，

因此需要先配置母液，母液可配置

50 ml,

称

量粉末大于

0.1 g

，这样会比较精准，在稀

释时可

次稀释

倍或

100

倍，如果一次

稀释倍数过高也会造成离子浓度不准。测试

液的配置参考

NISC

测试液标准，可适当调

整其中的离子浓度，但应满足一些必要条件：

测试液中要含有待测离子；测试液离子浓度

不能过高或过低，否则会影响检测的灵敏

度；测试液需要维持一定的

值以维持样

品的稳定性（细胞样品还需要调节渗透压）；

高浓度校准液和低浓度校准液只有待测离子

浓度不同，其余均与测试液一致，待测离子

浓度差

倍为宜；调节

值时不能使用

含有待测离子的溶液调节，可使用

Tris

和

MES

。

非损伤可检测的样品种类众多，植物

样品使用水培，土培，培养基培养均可进行

检测，但最适宜的是水培，这样表面干净，

使用土培和培养基培养时最好使用细毛笔轻

轻在检测部位刷一刷，将表面的杂质去掉，

然后在平衡液中浸泡后进行测试。

流速传感器的制作。首先取

支传感

器，注入

1cm

的灌充液，位置不要离尖端

太远，否则不容易将灌充液挤压到开口处。

然后将传感器连接到三通阀上，推动注射器

使灌充液上升到尖端并流出

滴，用嘴对着

传感器轻轻吹掉流出的液滴。用

LIX holder

蘸取

LIX

后固定在显微操作台，慢慢推动

压力调节装置使

LIX holde

形成

个凸面并

高级研修班结业心得

《NMT 通讯》第二期

调整焦距使画面清晰，然后慢慢调整传感器

位置使传感器尖端插入

LIX holder

凸液面使

LIX

流入传感器，轻轻推动三通阀往返几次

之后将

LIX

液柱调整到合适长度，将流速传

感器与

LIX

液面分离。

流速传感器调整时要手动自动结合。

测试时流速传感器尖端要浸入液面，不能只

浸入一点，会影响检测效果，同时也不能浸

入液面过深，有可能碰到培养皿的底部导致

尖端碰破。因此在调整传感器位置时最好先

将传感器放下至液面或接近液面，然后旋

转

轴旋钮使传感器慢慢下降，待尖端浸入

液面后再适当调整

轴和

轴使传感器尖

端处于画面正中间。最后打开自动开关，使

用自动调整使尖端清晰显像，观察尖端是否

完整没有破碎。在校准时可按照高浓度校准

液、低浓度校准液、测试液的顺序进行校准，

每次校准都需要稳定后才能更换下一个校准

液。

校准液校准出错的一些原因：（

）

个溶液检测值都很低，没有什么差别，这可

能是机器没有开机，检查开关按钮是否打开；

（

）

个溶液检测值都很高，远高于正常值，

这可能是电路没有闭合，检测参比电极是否

放入液面；（

）

个溶液检测值在合理范

围内且

个浓度存在梯度差异，但是斜率不

对，这可能是校准液配置有问题，可以先将

高浓度校准液稀释

倍进行检测，若可以

校准，说明用母液稀释时不准确，若不可以

校准，说明存在其他问题，如在检测钠离子

时加入了过多的钾离子影响了检测。

实验方案的设计是

NMT

测试的重要一

环，以下是我自己曾做过的一些实验方案：

植物在盐胁迫下钾离子的流动。钾

离子是植物生长必须的大量元素，在植物营

养、膨压调节和渗透平衡等方面都有着重要

作用。高盐碱环境会形成高渗透压，使植物

失水，影响植物的正常生长。检测样品使用

拟南芥，取生长

天，长势相似的植株，放

入

100 mM NaCl

溶液中处理

小时，对照

使用不含

NaCl

的溶液。将处理好的材料放

入测试液浸泡

30 min,

然后更换新的测试液，

并用滤纸条和树脂块将样品固定。流速传感

器检测根尖的钾离子流速。

植物根在低温处理下钙离子流速的变

化。钙是植物信号传递的第二信使，在信号

转导和植物生长发育调节中都有重要作用。

水稻受到低温冷害会影响正常发育，导致减

产，因此研究水稻在低温下钙离子传输的变

化对与低温刺激的研究具有重要意义。实验

时先将水稻样品放入测试液平衡

30 min

，平

衡好后更换新的测试液检测

5 min,

待数据稳

定后，在外侧培养皿加入碎冰创造低温条件，

检测低温处理时钙离子的流动。

重金属处理后植物根部的吸收情况。

镉元素是一种毒性很强的重金属元素，属于

类致癌物，如果植物体内积累一定浓度的

镉元素，就会影响植物的生长和发育。镉胁

迫通常起到低浓度下刺激植物幼苗生长，高

浓度下抑制幼苗生长的效果。使用拟南芥为

研究材料放入含有

0.05 mM

镉的测试液中平

衡

30 min

。更换新的测试液，固定样品，检

测根部镉离子流速。

非损伤微测技术历经多年发展，已成为

电生理实验中的一种重要方法，有着其它实

验不可替代的优点，非损伤微测技术的应用

高级研修班结业心得

《NMT 通讯》第二期

大大促进了离子分子流速信号的研究进展。

对于旭月公司筹办研修班，推广非损伤微测

技术的社会责任感感到由衷的钦佩，也十分

荣幸参与到本次研修班的学习中，让我学习

到了许多

NMT