《NMT 通讯》第二期
50
李映
中国科学院华南植物园，广州，510650
摘要：
非损伤微测技术（
Non-invasive Micro-teat Technique
，
NMT
）是一种超高灵敏度，非
接触方式、以流速为单位，可用于实时测定活体外微环境中的离子或分子浓度及其梯度的技
术。
NMT
技术通过选择性微电极进行电信号的采集、图像的实时捕捉和电极的运动控制，
能够实现对活体样品离子或分子的三维运动分析，被应用于基础生物学、植物生理学、基础
医学、动物学、环境科学和微生物学等各大领域。基于
NMT
技术可用于活体检测的优势，
简要介绍了其在植物生理中的应用及工作量亮点，并结合自身研究领域内容对
NMT
技术的
应用前景进行了展望，以期为日后的研究工作提供更多的研究思路和理论基础。
关键词：
非损伤微测技术，离子浓度，
Ca
2+
1. 非损伤微测技术及其原理
非损伤微测技术（
Non-invasive Micro-
teat Technique
，
NMT
）由美国海洋生物学
实验室神经科学家
Lionel F. Jae
发明，并
于
1990
年在测定细胞
Ca
2+
运动方向和流
速的应用中获得成功后正式问世 (
Li et al.,
2021
; 宋雪皎等 ,
2017
) ，是一种超高灵
敏度，非接触方式、以流速为单位，可用
于实时测定活体外微环境中的离子或分子
浓度及其梯度的技术。该技术包括扫描离
子选择性电极技术（
Scanning Ion-selective
Electrode Technique
，
SIET
）、微电极离子
流技术（
Microelectrode ion ux estimation
technique
，
MIFE
）等多种微电极技术 ( 宋
雪皎等 ,
2017)
。
NMT
集显微镜成像、信号放大及采集、
屏蔽防震、马达驱动控制精密运动和视频转
非损伤微测技术及其应用
换等设备于一体，依托计算机软件对离子信
号进行图像捕捉、数据处理和电极运动控制，
在不接触样品的情况下，获得进出样品的各
种分子 / 离子的浓度、流速及其三维运动方
向的信息 ( 李静等 ,
2014
)。NMT 技术的原
理是通过选择性微电极和微传感器获取信
号，其中离子选择性微电极由玻璃微电极、
Ag/AgCl
导线、电解质及液态离子交换剂
（
Liquid Ion Exchanger
，
LIX
）组成。以已
知中
dx
进行两点测量，分别获得电压
V
1
和
V
2
。两点间的浓度差
dc
则可以从
V
1
和
V
2
及已知的该微电极的电压 / 浓度校正曲线计
算获得。基于
Nernst
方程和
Fick’s
第一扩
散定律，
D
表示离子的扩散常数，代入公式
J0= -D
（
dc/dx
）可计算离子的浓度和移动速
度 ( 丁亚男和许越 ,
2007
)。
收稿日期：
2022-12-09
编辑作者
E-mail: yanhan@nmtia.org.cn
高级研修班结业心得
《NMT 通讯》第二期
51
选择性电极进行检测时，检测信号首先
会被传输到前置放大器中，由信号处理器到
达数据采集系统，通过计算机微测软件进行
数据的记录、显示和处理，并可以显示和分
析双通道及以上的数据；同时，光学显微镜
和视频转换器可对待测样品和选择电极进行
实时图像捕捉和监控；此外，运动控制器与
位移传递架上的驱动器连接，可实现对选择
电极的运动控制 ( 宋雪皎等 ,
2017
)。
NMT
可检测的样品可以是细胞器、植
物原生质体、单个或多个细胞、组织、器
官甚至整个生物体，
H
+
、
Na
+
、
K
+
、
Ca
2+
、
Mg
2+
、
Cd
2+
、
NH
4
+
、
NO
3
-
、
O
2
、
H
2
O
2
、
IAA
等多种离子或分子均可被检测。与其他检测
技术相比，具有独特的优势和实用性：（
1
）
NMT
技术维持了待测样品的完整性和生理
活性。在与样品实际生理条件相似的液体环
境中进行一维、二维或三维运动检测，对活
体内部的生理活动未造成任何干扰和破坏。
（
2
）
NMT
技术具有较高的时空分辨率和灵
敏度，其对离子和分子的空间分辨率分别可
达
0.5 μm
和
2 μm
等 ,
2017
)，能检测到的
离子流速可达到
10
-12
mol
·
cm
-2
·
s
-1
。（3）
NMT
技术可实时或长时间检测样品内离子
或分子的动态运动过程，通过计算机软件的
数据采集、实时图像捕捉和监控，可进一步
分析离子 / 分子的浓度梯度，进而揭示离子
或分子运动的方向。
近年来，
NMT
技术的应用逐渐得到推
广，其在基础生物学、植物生理学、神经生
物所学、基础医学、病理学、动物学、环境
科学和微生物学等诸多领域的实验中取得了
大量的科研成果和突破；国内各大学者基于
已有的研究结果总结了
NMT
技术在环境科
学 ( 季丹丹等 ,
2015
)、生物医学 ( 丁亚男
和许越 ,
2007
)、植物生理生态 ( 贾代东等 ,
2017
)、植物抗逆生理 ( 李静等，
2014
)等
方面的应用，为开展离子动态平衡、揭示生
物内部分子机制等研究提供研究思路和理论
参考。
2.NMT 技术的应用及其工作亮点
得益于其高灵敏度和动态实时的监测功
能，在各种植物中
NMT
技术的应用获得了
较多突破性的研究成果，本文从植物抵抗冷
害胁迫、调控气孔运动等方面简述部分学者
具有代表性的研究成果。
2.1 NMT 技术验证植物保卫细胞 Ca
2+
内流
和K
+
外排介导气孔关闭
植物褪黑素具有促进植物生长、生
根诱导、促进种子萌发、优化光合效率、
调节内部生物钟和成熟衰老过程等功能 (
Arnao and Hernández-Ruiz, 2015
)，也可以
作为内源性生物刺激物对抗非生物或生物
应激源 (
Arnao and Hernández-Ruiz, 2014;
Arnao and Hernández-Ruiz, 2018;Yanping et
al, 2018
)。
H
2
O
2
和
Ca
2+
是植物生长发育、
环境响应和气孔孔径的重要信号分子 (
Julia
et al., 2003
)，
H
2
O
2
的产生由细胞膜定位的
NADPH
氧化酶介导 (
Kwak June M et al.,
2003;Moshe and Robert, 2006
)，激活
Ca
2+
通
道并增强
Ca
2+
内流，导致内向钾电流失活，
促进气孔关闭 (
Pei Z M et al., 2000;Yizhou
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《NMT 通讯》第二期
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et al, 2013
)。受
G
蛋白
α
亚基激活的
H
2
O
2
参与了乙烯和油菜素内酯诱导的拟南芥气
孔关闭。
Zhang
等人 (
Jian et al., 2018
) 利用
扫描离子选择性微电极技术，测量拟南芥保
卫细胞中的
K
+
和
Ca
2+
通量，揭示了褪黑素
能刺激
Ca
2+
内流和增加
K
+
外流，并验证了
CAND2
是一种
G
蛋白偶联受体，通过
Gα
介导的
Ca
2+
信号感知促进气孔关闭及
K
+
流
出的植物褪黑素信号。褪黑素与
CAND2
受
体结合，从而激活
NADPH
氧化酶依赖的
H
2
O
2
生产，增强
Ca
2+
内流并促进
K
+
外排 (
Jian
et al., 2018
)。
同样的，中国农科院王耀生团队利用
NMT 技术原位检测大麦叶片保卫细胞内
K
+
、
H
+
和
Ca
2+
的流速，对比了野生型
WT
和聚
乙二醇（
PEG
）处理中三种离子的流速差异。
结果显示
PEG
处理后的大麦叶片
ABA
浓度
和
Ca
2+
浓度显著增加。该研究验证了干旱
胁迫下，叶片
ABA
浓度的增加与
K
+
外排速
率和
Ca
2+
内流速率的增加以及气孔导度的
降低相一致 (
Li et al, 2021
)，为
ABA
介导
保卫细胞离子转运从而调控大麦气孔运动提
供了新的研究思路。
该研究利用
NMT
技术验证了受体蛋白
或激素介导保卫细胞离子内流和外排的机
制，进而调控叶片气孔关闭，不仅可以保持
待测样品具有完整的细胞形状，还能观察气
孔开关的动态变化，为日后研究气孔开关调
控机制提供了新的思路和方法。
2.2 COLD1 激活 Ca
2+
通道和 GTP 酶活性赋
予水稻耐寒性
植物细胞读温度差异的适应依赖于特定
的分子细胞途径，包括
Ca
2+
介导的信号转导。
水稻
COLD1
（
CHILLING TOLERANCE
DIVERGENCE 1
）编码定位于质膜和内质网
的
G
蛋白信号调节因子。它与
G
蛋白
α
亚
基相互作用，激活
Ca
2+
通道以感受低温并
加速
G
蛋白
GTPase
活性。中国科学院植物
研究所种康院士团队利用扫描离子选择电极
技术，检测水稻根系对冷凉刺激反应的
Ca
2+
通量，进一步揭示
COLD1
介导了寒冷引
起的
Ca
2+
内流和
[Ca
2+
]
cyt
的变化 (
Ma et al.,
2015
)。
NMT
技术的设备通过光学显微镜与计
算机核心软件，将活体生物中微小的离子和
分子运动转换成可视化的形式，一方面，待
测样品无需经过研磨冷冻等灭活处理，也不
需要进行染色或放射性同位素的附着，保持
了正常的生理活性，为实验研究节省了大量
的时间和成本；另一方面，能够对样品进行
三维的长时间监测是普通实验技术所实现不
了的。听取和阅读了各大学者将 NMT 技术应
用于自己的研究课题之后，让我看到了 NMT
技术在诸多研究领域特别是离子和分子动态
变化方面有着很大的应用价值和发展前景。
尽管这项技术在国外已经得到广泛应用并获
得了较多的实验成果，但在国内该技术仍属
于创新技术，可作为文章锦上添花的一部分，
因此仍需积极推广以及完善实验技术体系。
3. 对 NMT 技术应用于个人实验研究
中的未来设想
经过直播课程及文献的学习，结合自
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己所研究的专业领域，对日后冷害胁迫下荔
枝果皮褐变的实验设计了以下研究思路及设
想。
果皮水分散失、病原菌侵染、果实自
然衰老褐变等都是水果采后褐变的诱因，其
褐变的机制主要是细胞中发生了酶促氧化反
应。在衰老和逆境条件下，细胞膜的流动性
和透过性发生改变，细胞区格化丧失，导致
多酚氧化酶核过氧化物酶与酚类底物接触，
将其氧化成醌，后者再进一步脱水缩合，最
后形成黑褐色物质，导致果皮褐变 ( 蒋跃明
等，
2002
)。低温会导致氧化还原失衡而产
生过量的活性氧（
ROS
），它能氧化不同细
胞成分，导致膜脂质过氧化、蛋白质氧化
和核酸受损 ( 田世平，2013)。褪黑素本身
作为一种强大的自由基清除剂，能够通过
直接中和有毒
ROS
保护细胞免受氧化损伤
(
Arnao and Hernández-Ruiz, 2018;Tan et.al,
2015
)。
ATPase
活性的变化直接影响着细胞
的能量代谢和质膜的功能，而
Ca
2+
-ATPase
可以把细胞质内过多的
Ca
2+
转运到细胞外
或细胞器内贮藏起来，以维持细胞内
Ca
2+
稳态，进而保持细胞膜的完整性，延缓果实
衰老 (
Tran et.al, 2014)
。
基于上述理论基础，本实验通过预实
验观察不同浓度褪黑素处理荔枝并贮藏于
4℃
低温中，确定最佳褪黑素处理浓度。将
各处理和对照组荔枝置于
4℃
冷库中，并
记录
0d
、
2d
、
4d
和
6d
的呼吸强度、褐变指
数等生理指标，分别取适量果皮样品，用于
NMT 设备检测细胞内外
Ca
2+
和
H
+
浓度等。
另取适量果皮样品用液氮研磨成粉末，贮藏
于
-80℃
冰箱，用于后续开展生理实验。利
用生物信息学的方法，筛选拟南芥和荔枝基
因组中褪黑素受体的同源基因，结合分子生
物学实验，对所选基因进行克隆和验证是否
调控细胞膜
Ca
2+
浓度和
H
+
浓度变化，以调
控果皮褐变。
NMT
技术在果蔬采后生理中的应有在
国内鲜有报道，如何对果皮进行取样观察并
保持荔枝果皮不被二次氧化是本实验中的难
点之一，对
LIX
浓度的筛选和试验也是一大
挑战，尽管如此，我们仍希望对此进行尝试，
以期探索出对果皮细胞膜离子检测的完整的
实验体系，并应用于后续更多的实验材料的
检测中。
4. 未来展望与建议
NMT
技术是一种实时、动态、高灵敏
度的综合性电生理技术，随着其自身硬件设
施的完善、测量样品种类的增加、测量技术
的成熟，它对现有的电生理技术（如膜片钳
技术）做出了重要补充，是鉴定或验证某些
生物膜运输系统功能的有力工具，未来发展
潜力和应用范围都将会继续扩大。
尽管如此，
NMT
技术仍有需要改进的
不足之处：首先，
LIX
与各种样品及离子 /
分子的适配度不够高，在实际应用中仍需自
己配制
LIX
或进行优化；抑或是如何保证样
品在
LIX
中保持原有的生理状态，如上述所
提及的如何防止荔枝果皮在
LIX
中不被二次
氧化。其次，自动化程度有待提高，在测量
时仍需手动调整以接近样品，这样容易损害
传感器；此外，电极的拉制手法过于精细，
电极的好坏对接触样品后的封接效果有较大
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《NMT 通讯》第二期
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的影响，但期间需要花费的时间较长。
NMT
技术在活体生理功能的研究中能
够发挥巨大的作用，希望日后相关的配套设
施能够进一步的更新和推广，加强与其他先
进检测技术的综合应用，突出 NMT 的比较优
势，助力现代生命科学科研平台的建设；加
强系统平台和技术人员梯队建设，优化技术
程序，突破“卡脖子技术”，拓展 NMT 技术
的应用领域，推动各个学科的发展，取得更
具创新性、研究性和突破性的研究成果。
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