北林：NMT发现NO促Pb吸收并诱导Ca2+流紊乱 为NO增强Pb毒性的机制研究提供证据

---

微信原图文

感谢本文通讯作者，中国林科院国家林业和草原局盐碱地研究中心杨秀艳副研究员校稿

 

基本信息

主题：NMT发现NO促Pb吸收并诱导Ca²⁺流紊乱 为NO增强Pb毒性的机制研究提供证据

期刊：Plants

影响因子：2.632（2019年）

研究使用平台：NMT重金属创新平台

标题：Nitric Oxide Enhances Cytotoxicity of Lead by Modulating the Generation of Reactive Oxygen Species and Is Involved in the Regulation of Pb²⁺ and Ca²⁺ Fluxes in Tobacco BY-2 Cells

作者：北京林业大学荆艳萍、武佳叶、张越

 

检测离子/分子指标

Pb²⁺、Ca²⁺

 

检测样品

4日龄BY-2细胞

 

中文摘要

铅是已知对动植物都有毒害作用的重金属。据报道，一氧化氮（NO）参与植物对不同重金属胁迫的响应。本研究分析了外源和内源NO在铅诱导烟草BY-2细胞毒性中的作用，使用非损伤微测技术（NMT）重点研究了NO在活性氧（ROS）生成以及Pb²⁺和Ca²⁺流速中的作用。Pb处理诱导BY-2细胞死亡并迅速产生NO和ROS，而NO爆发发生早于ROS积累。2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide（cPTIO）消除NO导致ROS减少，硝普钠（SNP）补充NO导致ROS积累增加。此外，外源NO的加入刺激了Pb²⁺的内流，从而促进了细胞对Pb的吸收，加重了Pb对细胞的毒性，而去除内源性NO则产生了相反的作用。此外，研究还发现，外源性和内源性NO均增强Pb诱导的Ca²⁺外排和钙稳态紊乱。这些结果表明，外源和内源性NO通过促进Pb²⁺的内流和积累，干扰钙稳态，在Pb胁迫诱导的BY-2细胞死亡中发挥重要的调节作用。

 

 

离子/分子流实验处理

 

1、250 μM Pb(NO₃)₂处理BY-2细胞10 h

2、250 μM Pb(NO₃)₂+0.5 μM SNP处理BY-2细胞10 h

3、250 μM Pb(NO₃)₂+100 μM cPTIO处理BY-2细胞10 h

4、0.5 μM SNP、100 μM cPTIO实时处理

 

离子/分子流实验结果

本研究用250 μM Pb (NO₃)₂处理4日龄烟草BY-2细胞，立即用NMT测定Pb²⁺流速。250 μM Pb (NO₃)₂处理后，Pb²⁺内流速率恒定，平均值为70.40±2.70 pmol cm^-2·s^-1（图1A）。添加0.5 μM SNP后，Pb²⁺内流显著增加，达到160.56±32.83 pmol cm^-2·s^-1，显著增加128.06%。与单独Pb处理相比，100 μM cPTIO处理显著抑制了Pb²⁺的内流，甚至出现6.75±0.85 pmol cm^-2·s^-1的Pb²⁺净外排（图1A, B）。这些结果表明，在短时间内，SNP或cPTIO的存在显著改变了Pb (NO₃)₂处理下的的Pb²⁺流速。

图1. Pb胁迫下施用SNP和cPTIO前后NO对烟草BY-2细胞Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

      研究还测定了长期不同处理的细胞中Pb²⁺流速。如图2所示，单独Pb处理10 h时，烟草BY-2细胞内有Pb²⁺内流，其平均内流速率为34.94±2.98 pmol cm^-2·s^-1。添加SNP后，Pb²⁺平均流速显著增加，达到88.98±10.38 pmol cm^-2·s^-1。SNP存在时Pb²⁺流速的平均值约为单独Pb处理的2.55倍。然而， cPTIO处理下的细胞Pb²⁺外排速率最小，平均值为0.37±2.83 pmol cm^-2·s^-1。上述结果表明，NO增强了Pb²⁺向细胞内流入。

图2. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Pb²⁺流速的影响。正值代表Pb²⁺外排，负值代表Pb²⁺内流。

      钙作为营养和信号分子，在植物的各种生命活动中发挥着重要作用。在这项工作中，NO促进了Pb²⁺的流入并参与了BY-2悬浮细胞对Pb的吸收。我们进一步检测了NO对Pb诱导的Ca²⁺流速变化的影响。如图3所示，对照细胞检测到Ca²⁺流入烟草BY-2细胞，其平均值为13.54±2.78 pmol cm^-2·s^-1。Pb胁迫下，Ca²⁺内流受到抑制，由内流转变为外排，平均值为17.88±1.33 pmol cm^-2·s^-1。0.5 μM SNP处理的烟草BY-2细胞Ca²⁺外排速率（29.42±4.97 pmol cm^-2·s^-1）显著高于单独Pb处理的细胞。在100 μM cPTIO存在下，Ca²⁺的外排速率比单独Pb处理降低了13.18±0.91 pmol cm^-2·s^-1。然而，这种影响并不显著。这些数据显示NO增强了Pb诱导烟草BY-2细胞钙稳态紊乱。

图3. 不同处理10 h后NO对烟草BY-2细胞中Ca²⁺流速的影响。正值代表Ca²⁺外排，负值代表Ca²⁺内流。

 

结论

本研究表明，西伯利亚白刺的耐盐性主要表现在液泡Na⁺区隔化和细胞质K⁺稳态。未来的研究应侧重于其他细胞器（如内质网）作为细胞内Na⁺储存的潜在储存体的作用。同时，液泡含有水解酶、磷酸酶和磷酸酯酶等多种酶类，因而与泛素化等蛋白质修饰过程相联系。在液泡液中Na含量较高的情况下，液泡中的酶如何发挥作用还有待回答。

图4. NO通过调节ROS的产生，促进Pb²⁺向细胞内流，影响Ca²⁺稳态，增强Pb的细胞毒性作用示意图。

 

测试液

 

Pb²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.25 mM Pb(NO₃)₂, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

 

 

 

仪器采购信息

 

据中关村NMT产业联盟了解，北京地区的北京林业大学于2009年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统

 

 

原文链接：https://doi.org/10.3390/plants8100403

 

关键词：NO；Pb²⁺；流速；稳态；Ca²⁺；烟草BY-2细胞