山西医大祁金顺：NMT发现谷氨酸和Aβ诱导神经元Ca²⁺内流可被NMDA受体阻断剂逆转 为了解AD相关疾病的发生机制提供依据

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基本信息

主题：NMT发现谷氨酸和Aβ诱导神经元Ca²⁺内流可被NMDA受体阻断剂逆转 为了解AD相关疾病的发生机制提供依据

标题：GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂改善3xTg-AD小鼠学习记忆功能的电生理和分子机制研究

论文类型：山西医科大学硕士学位论文

作者：山西医科大学祁金顺、李甜

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺

 

检测样品

8月龄雄性C57BL/6小鼠脑片

 

中文摘要（谷歌机翻）
      AD的一个重要病理特征是脑内聚集有大量、高密度的淀粉样β蛋白（amyloid-βprotein, Aβ）。内源性Aβ的主要分子形式是Aβ_1-40和Aβ_1-42，两者均为β-分泌酶和γ-分泌酶作用于单链跨膜的淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）后的产物。研究表明，Aβ发挥神经毒性作用的活性中心位于25-35序列（Aβ_25-35）甚或 31-35 序列（Aβ_31-35）。实验室早期的研究曾发现，Aβ_31-35预处理可使小鼠培养的大脑皮层细胞凋亡、可抑制大鼠大电导钙激活钾通道的功能活性、还能损伤大鼠在体海马的突触可塑性和空间学习记忆能力。已经明确，作为细胞内第二信使，Ca²⁺在多种生命活动中扮演着重要的信号转导作用。同时，神经元细胞内发生的Ca²⁺超载又成为Aβ产生细胞毒性作用的一个离子机制。因此，快速、准确检测神经元跨膜Ca²⁺流的动态变化，不仅可以帮助了解细胞维持Ca²⁺稳态和正常功能活动的原理，也有助于揭示AD以及其他与Ca²⁺信号扰乱相关疾病的发生机制。目前，测定神经元跨膜Ca²⁺流的技术手段主要有：细胞内离子成像和电生理记录膜电流。然而，受技术所限，这些方法均有不尽人意之处。细胞内Ca²⁺成像往往局限于培养细胞水平，而且需要将Ca²⁺敏感的染料（如Fura-2和Fluo-4等）导入到细胞内，但染料本身可以影响细胞活性，还随时间延长和激发光持续作用出现淬灭。电生理技术可以直接测定跨膜Ca²⁺电流，但电极经封接、破膜进入细胞的过程已对细胞构成伤害，也很难进行长时间记录，且空间分辨率低、实验操作复杂。非损伤微测技术（NMT）是近年发展起来的一种以非接触方式直接 获取离子跨膜内流或外流流速的最新技术手段，其根据Fick第一扩散定律和Nernst方程，通过检测细胞外两点间电位差的改变，从而测得紧邻细胞膜的胞外离子变化情况。本研究采用NMT实时记录了小鼠海马脑片神经元Glu引起的跨膜Ca²⁺内流流速变化；探讨了Aβ_31-35对Glu所致细胞的兴奋作用及其机制；利用低钙人工脑脊液观察了跨膜Ca²⁺的外排过程，并深入探讨了Aβ_31-35对Ca²⁺外排的影响及其可能机制。

 

离子/分子流实验处理方法

海马脑片置于经混合气体饱和后的aCSF中，记录电极三维推进至脑片海马CA1区神经元正上方50 μm处，开启电极移动和电压采集程序，记录神经元在基础状态下2 min内和给予药物处理后5 min期间的Ca²⁺跨膜流动情况。药物处理包括：

（1）急性给予不同浓度的Glu
（2）急性给予不同浓度的Aβ_31-35
（3）不同浓度Aβ_31-35预处理后急性给予Glu
（4）Aβ_31-35联合D-APV或CNQX预处理后急性给予Glu
（5）急性给予低钙（0.35 mM Ca²⁺）aCSF液
（6）Aβ_31-35预处理后给予低钙 aCSF
（7）KB-R7943或TFH预处理后给予低钙aCSF
对照组仅给予溶解药物的溶剂（vehicle）。

 

离子/分子流实验结果

      在基础状态下，海马脑片CA1区神经元未记录到明显的Ca²⁺内流或外流，这种稳定状态至少可保持到60 min以上（结果未显示）。如图1A所示，作为给药前自身对照，基础状态下2 min内的Ca²⁺流速平均值接近零水平（0.17±0.1 pmol/(cm²·s)）。当分别急性给予不同浓度的Glu后，与对照组（仅给予vehicle）相比，各Glu给药组均即刻检测到快速的内向Ca²⁺流，流速由起始最大随给药时间延长而逐渐减慢并趋于稳定。经统计学处理，2.5 mM、5 mM、10 mM三个不同浓度的Glu组给药后5 min内的Ca²⁺流速平均值分别为-177.135±6.528pmol/(cm²·s)、-331.864±22.742 pmol/(cm²·s)和-498.03±55.783 pmol/(cm²·s)。三组不同浓度的Glu给药组之间也存在显著性差异（P<0.05）。这表明，急性给予Glu可浓度依赖性引起海马脑片CA1区神经元跨膜Ca²⁺内流。有趣的是，急性给予不同浓度的Aβ_31-35也诱发了海马脑片神经元出现先快后慢的内向跨膜Ca²⁺流。如图1C和1D所示，与对照组5 min内Ca²⁺流速（2.912±2.466 pmol/(cm²·s)）相比，10 μM、30 μM和50 μM Aβ_31-35组给药后5 min内出现的内向Ca²⁺流平均流速分别为-32.262±17.347 pmol/(cm²·s)、-129.838±26.610pmol/(cm²·s)和-310.297±35.231 pmol/(cm²·s)。这些内向Ca²⁺流也具有先快后慢并持续稳定的特征。同时，Aβ_31-35诱发的海马脑片CA1区神经元跨膜Ca²⁺内流具有浓度依赖性（P<0.05）。

 

图1. 急性给予Glu及Aβ_31-35引起海马脑片CA1区神经元Ca²⁺内流。负值代表Ca²⁺内流。

 

      如图2A所示，各组脑片在稳定记录2 min基础状态Ca²⁺流速基础上，除对照组给予vehicle外，其余给药组先用不同浓度的Aβ_31-35处理2 min，然后比较各组脑片 急性给予Glu（10 mM）后5 min内的平均Ca²⁺流速。结果可见，没有Aβ_31-35预处理时，Glu引起的平均Ca²⁺流速为-430.747±37.537 pmol/(cm²·s)（Vehicle+Glu）；不同浓度的Aβ_31-35预处理2 min后，Glu诱导的内向Ca²⁺流速较Aβ_31-35未预处理组（即单独Glu组）明显增大。10 μM Aβ+Glu组、30 μM Aβ+Glu组和50 μM Aβ+Glu组5 min内Glu诱发的Ca²⁺流速平均值分别为-1418.91±69.85pmol/(cm²·s)、 -2495.05±127.735 pmol/(cm²·s)、-3887.07±257.969pmol/(cm²·s)。三组之间，内向Ca²⁺流速也呈现浓度依赖性增强（P<0.001）。这表明，Aβ_31-35预处理对Glu诱发海马脑片神经元Ca²⁺内流具有明显的易化作用。

 

图2. Aβ_31-35预处理剂量依赖性增强Glu诱发的海马脑片神经元Ca²⁺内流。负值代表Ca²⁺内流。

 

      为了检查Aβ_31-35对Glu诱发Ca²⁺内流的易化作用机制，我们比较了单独给予Aβ_31-35以及联合给予NMDA受体阻断剂D-APV（100 μM）或AMPA受体阻断剂CNQX（20 μM）预处理的效应。如图3所示，正常对照组（Viehcle+Glu）Glu引起的Ca²⁺内流平均流速为-571.253±57.129 pmol/(cm²·s)；Aβ_31-35预处理（Aβ_31-35+Glu）可使其易化至-3944.539±340.557pmol/(cm²·s)，增加了5倍之多；Aβ_31-35联合D-APV（D-APV+Aβ+Glu）后，Glu诱发的Ca²⁺内流显著减小至-116.345±47.786 pmol/(cm²·s)（P<0.001）；而联合给予CNQX（CNQX+Aβ+Glu）后，Glu诱发的Ca²⁺内流流速仍保持在-3049.358±210.551 pmol/(cm²·s)，虽有一定程度减小，但效应明显小于D-APV联合给药组（图3A, B）。

 

图3. NMDA受体阻断剂D-APV逆转了Aβ_31-35对海马脑片神经元跨膜Ca²⁺内流的易化作用。负值代表Ca²⁺内流。

 

      钙稳态的维持不仅涉及到Ca²⁺内流及其调节，依靠细胞能量系统实现的主动Ca²⁺外排可能是更重要的另一方面。为此，我们利用NMT检测了海马脑片在低钙 aCSF条件下出现的外向Ca²⁺流，并探讨了Aβ_31-35预处理对Ca²⁺外排的作用和可能机制。如图4A所示，将电极移至海马记录部位时，正常对照组基础状态下2 min内的Ca²⁺流速接近零水平，给予vehicle后5 min内Ca²⁺流速平均值也基本没有变化（0.837±0.499 pmol/(cm²·s)）。但将正常aCSF换为低钙（0.35 mM Ca²⁺）aCSF（Vehicle+Low[Ca²⁺]_o）后，可记录到一个明显的外向Ca²⁺流，峰值快速达到5186.969±300.595pmol/(cm²·s)，随后逐渐回落，5 min时基本稳定在3337.39±231.405 pmol/(cm²·s)上下。统计学处理（图4B）表明，单纯低钙液（Veihcle+Low[Ca²⁺]_o）诱发的Ca²⁺外排5 min内平均流速为3867.868±244.502 pmol/(cm²·s)。有趣的是，Aβ_31-35（50 μM）预处理（Aβ_31-35+Low[Ca²⁺]_o）可部分阻断这种 低钙aCSF诱发的Ca²⁺外排，5 min内平均Ca²⁺流速只有2541.532±440.146 pmol/(cm²·s)。接着，我们用质膜钙泵阻断剂TFH或质膜钠钙交换体阻断剂KB-R7943分别预处理，以检查这种低钙液诱发的Ca²⁺外流机制。我们发现，两种阻 断剂在正常aCSF中并不影响基础性的Ca²⁺流，但用TFH（100 μM）预处理（TFH+Low[Ca²⁺]_o）后，低Ca²⁺液引起的Ca²⁺流速较TFH未处理组明显减少，平均流速降低到1954.733±327.616 pmol/(cm²·s)；用KB-R7943（100 nM）预处理（KB-R7943+Low[Ca²⁺]_o）后，低Ca²⁺液引起的Ca²⁺流则大幅度减少，平均流速只有352.828±75.665 pmol/(cm²·s)，抑制程度远大于TFH。这说明，低Ca²⁺液引起海马脑片CA1区神经元的Ca²⁺外排主要是质膜上Na⁺/Ca²⁺交换体介导的，Na⁺/Ca²⁺交换体可能也是Aβ_31-35抑制Ca²⁺外排的主要靶点。

 

图4. Aβ_31-35预处理抑制了海马脑片CA1区神经元低钙aCSF诱发的Ca²⁺外流。负值代表Ca²⁺内流。

 

其他实验结果

• 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可改善3xTg-AD小鼠短期和长期的学习记忆认知行为。

• 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg 三受体激动剂可减轻3xTg-AD小鼠在体海马CA1区突触可塑性的损害。

• 长期暴露于氧化还原活性Cu(II)-Aβ_1-40会导致皮质神经元轴突完整性的进行性改变。

• 腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可阻止3xTg-AD小鼠海马组织中的^S133p-CREB、^T286p-CAMKII和^S9p-GSK3β的水平下调。

 

测试液

120 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃,10 mM D-glucose, 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH7.3~7.4

 

结论

      本研究初步表明：长期慢性腹腔注射GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂可显著改善3xTg-AD小鼠的学习记忆行为；三受体激动剂Triagonist同时还改善了3xTg-AD小鼠海马CA1区的突触可塑性；Triagonist处理还提高了上述 3xTg-AD 小鼠海马组 织中与学习记忆功能密切相关的^S133p-CREB、^T286p-CAMKII和^S9p-GSK3β的表达水平。这些结果提示，GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂有可能成为预防和治疗AD尤其是伴有T2DM或血糖异常AD的一种新策略。

 

 

 

原文链接：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&dbname=CMFD201801&filename=1017848874.nh&uniplatform=NZKPT&v=ihL1fGZoKOF6u1oTbGHs7ZYXCR0LdLw8UdnhJ_unZj2_QqoVvj_RJV6GZRGpJ3o9

 

供稿：赵雪琦
编辑：杨爽
校稿：卻彦晗

 

关键词：GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂；3xTg-AD；学习和记忆；长时程增强；^S133p-CREB；^T286p-CAMKII；^S9p-GSK3β；淀粉样β蛋白；非损伤微测；跨膜Ca²⁺；生医动物类