ACS Nano江苏师大孙健/华南农大雷炳富：NMT为碳点的Ca2+动员特性能提高植物环境胁迫适应性提供核心数据
 

 

 

基本信息

主题：NMT为生物质衍生碳点的Ca²⁺动员特性能提高植物环境胁迫适应性提供关键证据

期刊：ACS Nano

影响因子：15.88

研究使用平台：NMT植物耐盐创新平台

标题：The Calcium-Mobilizing Properties of Salvia miltiorrhiza-derived Carbon Dots Confer Enhanced Environmental Adaptability in Plants

作者：江苏师范大学孙健、李艳娟、潘志远，徐州农业科学研究所唐忠厚，华南农业大学雷炳富，农业农村部环境保护科研监测所王瑞刚

 

检测离子/分子指标

Ca²⁺、K⁺、Na⁺

 

检测样品

甘薯根（距根尖1.5mm、2mm、3mm、10mm、30mm）

拟南芥根（距离根尖1mm、2mm）

 

中文摘要

      生物质衍生碳点（CDs）是一种很有前景的农业纳米工具，可以作为活性氧（ROS）的清除剂，缓解植物在恶劣环境下的氧化应激。尽管如此，植物需要ROS爆发来充分激活Ca²⁺调节的防御信号通路。CDs在没有ROS的情况下提高植物环境适应性的根本机制在很大程度上是未知的。本研究中，以丹参作为碳源合成的CDs在植物根系中引发了非ROS依赖的Ca²⁺动员。机理研究认为这种功能主要是由于CDs上的羟基和羧基造成的。CDs触发的Ca²⁺动员依赖于环状核苷酸和环状核苷酸门控离子通道的产生。凝集素受体激酶被证实是这种Ca²⁺动员所必需的。CDs水培应用促进了盐分和营养缺乏条件下的Ca²⁺信号传导和植物环境适应性。所有这些发现都表明CDs具有Ca²⁺动员特性，因此可以作为同时的Ca²⁺信号放大器和ROS清除剂用于作物改良。

 

离子/分子流实验处理方法

1.5mg/mL CDs瞬时处理

CDs、SWE处理30分钟

0/1.5mg/mLCDs+ 50/100/150mM NaCl

0/1.5mg/mL CDs+缺K⁺（低K⁺胁迫）预处理20-30分钟

0/1.5mg/mLCDs+Fe²⁺-EDTA（低Fe胁迫）预处理20-30分钟

1mM 四氧嘧啶/20 μM LY83583预处理1小时，1.5mg/mLCDs处理30分钟

CDs+苯甲酸酐（BA）/2-溴-1-苯乙醇（BrPE）/苯肼（PH）处理20分钟

CDs-10%SAB、CDs-30%SAB处理30分钟

CDs/100μM阿米洛利/10mM EGTA/100μM GdCl₃+NaCl处理6 h

 

 

离子/分子流实验结果

      为了探究生物质衍生碳点（CDs）是否会影响Ca²⁺转运，研究用非损伤微测技术（NMT）检测了甘薯根部Ca²⁺流速动力学。结果表明，CDs处理30 min后导致甘薯根中Ca²⁺内流速率逐渐增加。与对照相比，CDs处理（30-60 min）显著提高Ca²⁺平均内流速率和峰值（图1）。这些结果表明，所制备的CDs具备Ca²⁺动员能力。

图1. 丹参衍生的CDs对甘薯根部伸长区Ca²⁺流速动力学的影响。正值代表离子外排，负值表示离子吸收，下同。

 

       然而，碳前体（丹参）的水提取物（60°C，持续6h）并未在甘薯根中诱导任何Ca²⁺响应（图2），这表明CDs在植物中的Ca²⁺动员作用与其纳米尺寸特征有关。类似地，在其他植物物种的根中观察到CDs引发的Ca²⁺内流，包括三种双子叶植物（拟南芥、烟草和饭豆）和三种单子叶植物（水稻、小麦和玉米）（图3）。这些结果表明，所制备的CDs的Ca²⁺动员功能与植物种类无关。

图2. 丹参粉水提液（SWE）不能诱导甘薯根系Ca²⁺内流。

 

图3. CDs在拟南芥、烟草、饭豆、水稻、玉米和小麦的根中引发Ca²⁺的内流。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       前期研究表明，苯甲酸酐（BA）、2-溴-1-苯乙醇（BrPE）和苯肼（PH）作为高特异性失活剂，在温和的反应条件下，能选择性地灭活CDs表面的C-OH、COOH和C=O。结果表明，在CDs-BA和CDs-BrPE处理的甘薯根部，CDs触发的Ca²⁺内流被显著阻断；CDS-PH对CDs诱导的Ca²⁺内流的抑制作用均显著弱于CDs-BA和CDs-BrPE（图4和图5）。

图4. CDs和CD衍生物处理30 min对甘薯根部Ca²⁺流速动力学的影响。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

图5. CDs诱导拟南芥根系Ca²⁺内流需要CDs表面的羟基和羧基。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       由于CDs上的官能团主要来源于碳前体，因此选择不同酚羟基和羧基含量的生物质前体对合成CDs的Ca²⁺动员功能具有重要意义。为了进行假设检验，比较了两种不同丹酚酸B（SAB）含量的丹参粉合成的CDs对Ca²⁺的诱导活性，即10%（本研究）和3%（前期研究），结果表明，本研究所用的CDs在甘薯根系中表现出比先前合成的CDs更高的Ca²⁺内流诱导活性（图6）。

图6. CDs的Ca²⁺内流诱导活性与丹参前体中SAB含量有关。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       尽管植物基因组不编码动物体内的Ca²⁺选择性渗透离子通道亚基，但几种类型的Ca²⁺渗透阳离子通道促进了植物细胞PM中的Ca²⁺内流，如CNGCs、离子型谷氨酸受体、机械敏感性样通道和膜联蛋白。本研究鉴定了参与CDs触发植物根系Ca²⁺动员的Ca²⁺渗透阳离子通道的具体类型。在CDs处理的甘薯根系中发现K⁺内流增强（图7），表明CDs激活阳离子通道的非选择性特征。鉴于植物CNGCs是超极化激活的非选择性阳离子通道，它们最有可能促进CDs诱导的Ca²⁺动员。

图7. CDs会触发甘薯根部的K⁺内流。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       四氧嘧啶和6-苯胺-5,8-喹诺二酮（LY83583）分别是腺苷环化酶（AC）和鸟苷环化酶（GC）的两种特异性抑制剂。结果表明，四氧嘧啶和LY83583处理后，CDs触发的Ca²⁺内流速率显著降低（图8）。这些结果表明，cAMP和cGMP的产生是CDs触发的Ca²⁺动员所必需的，而CNGCs可能被cNMP激活。

图8. CDs和四氧嘧啶（alloxan）/LY83583处理30 min对甘薯根部Ca²⁺流速动力学的影响。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       研究进一步对拟南芥的几个CNGCs突变体进行了Ca²⁺响应检测，以确定 CNGCs是否有助于CDs触发的Ca²⁺动员，并确定CNGCs的相关分子特性。CDs处理20min后，与野生型（Col-0）相比，dnd1（CNGC2功能突变体缺失）和cngc20（CNGC20功能突变体缺失）拟南芥根部Ca²⁺内流速率显著降低。在这两个突变体中，CDs触发的Ca²⁺平均内流速率和峰值分别降低了53%至92%和53%至86%。此外，与Col-0植株相比，lore（LORE功能缺失突变体）植株根部CDs诱导的Ca²⁺内流速率显著降低（图9）。这些发现进一步证明了CDs上的C-OH和COOH官能团是激活LORE介导的CDs感知和随后的Ca²⁺动员的分子决定因素。

 

图9. CDs处理20 min对7日龄拟南芥幼苗根部Ca²⁺流速动力学的影响。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       CNGC2和CNGC20分别与CNGC4和CNGC19以异四聚体形式促进Ca²⁺的内流。因此，在cngc4-5（CNGC4功能缺失突变体）和cngc19突变体（CNGC19功能缺失突变体）的根部也检测了CDs引起的Ca²⁺内流。这两个突变体在CDs处理后表现出Ca²⁺动员受抑制（平均Ca²⁺内流率减少41%至44%）（图10）。这些结果提示CDs刺激植物根系产生cAMP和cGMP，超极化MP作用下配体激活了CNGC2/CNGC4和CNGC19/CNGC20异构体。然而，其他CNGCs或其他Ca²⁺渗透阳离子通道也可能参与这一过程。

图10. CNGC4和CNGC19在调节CDs诱导的拟南芥根Ca²⁺内流中起重要作用。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       CNGCs通常被病原体感染和细胞表面模式识别受体（PRRs）激活，这些受体需要感知与病原体相关的“非自我”分子。因此，某些PRRs可能在PM处感知CDs，从而激活CNGCs。油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1（BAK1，细胞膜局部受体激酶）和胰蛋白酶诱导激酶1 （BIK1，受体样胞质激酶）是两种受体激酶，在病原体胁迫下磷酸化CNGC2/4和CNGC19/20，以诱导Ca²⁺内流。本文研究了BAK1和BIK1是否参与CDs介导的拟南芥Ca²⁺动员。与野生型相比，bak1（BAK1功能缺失突变体）和bik1（BIK1功能缺失突变体）在CDs刺激下均未表现出根系Ca²⁺内流的受损（图11）。这一结果表明，在CDs刺激的根系中，不需要BAK1和BIK1来激活CNGC。此外，还比较了野生型和其他PRRs突变体（DORN1和CERK1）以及具有GC或AC活性的受体激酶（LRRAC1、PSKR1和WAKL10）对Ca²⁺在根中的诱导作用。然而，这些受体激酶突变体均未表现出CDs刺激后Ca²⁺内流受抑制（图11）。

图11.CDs在拟南芥各种受体激酶突变体的根中引发Ca²⁺内流。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       CNGCs在植物的生长、发育、胁迫感知和信号转导中起着重要作用。鉴于CDs激活植物CNGCs，这些NPs还可能通过增强CNGC介导的Ca²⁺信号而不需要ROS来改善植物的环境适应性。这一假说在盐胁迫下的甘薯植株中得到了验证，这是一种典型的环境胁迫，在这种环境胁迫下，植株利用“ROS-Ca²⁺枢纽”进行生存。结果显示，CDs在根尖（伸长区）Ca²⁺内流增加（图12a-c）。盐胁迫40 min后，ROS的产生也明显减少（图12a-d），说明CDs增强了Ca²⁺信号，而没有盐胁迫下ROS的爆发。相应地，盐诱导的根尖Na⁺外排，反映了Na⁺/H⁺逆向转运跨PM的活性，在CDs存在下增强了约3.6倍（图13a,b）。在阿米洛利（Na⁺/H⁺逆向转运抑制剂）、EGTA（细胞外Ca²⁺螯合剂）和CdCl₃（PM Ca²⁺通道抑制剂）的存在下，这种CDs增强的根尖Na⁺外排作用被显著抑制（图13c）。这一发现表明Ca²⁺信号参与了CDs增强Na⁺/H⁺逆向转运活性的调节。CDs也显著增强了野生型拟南芥幼苗盐渍化根中的Na⁺外排，但在dnd1突变体中没有观察到这种作用（图14）。这一结果证实了CNGC2参与了CDs刺激的SOS信号通路。

图12. 在盐分或养分缺乏条件下，CDs增强了甘薯根系Ca²⁺内流。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       CDs未能刺激甘薯植株成熟根区的Na⁺外流（图13a, b）。这种现象可能归因于CDs对该根区Na⁺吸收的抑制作用（图15a, b）。cGMP可以抑制拟南芥根原生质体对Na⁺的吸收。CDs增加了cGMP水平并显著激活CNGC2，这是一种非选择性阳离子通道，可透过Ca²⁺和K⁺，但不能透过Na⁺。结果表明，植物根系PM中Na⁺的选择性降低，从而限制了外部Na⁺的吸收。

图13. CDs增强盐胁迫条件下甘薯根伸长区Na⁺的外排活性。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

       CNGC2对K⁺具有透过性，并且Ca²⁺信号传导参与了在有限K⁺条件下介导K⁺吸收。因此，本研究结果支持了CDs可能通过激活CNGCs提高植物K⁺利用效率的可能性。下一步实验确定CDs加速甘薯根系对K⁺的吸收（图16a, b）。在缺铁早期，CDs对根系Ca²⁺动员也有类似的促进作用（图12i-1）。

图14. CDs刺激盐渍拟南芥根中的钠外排依赖于CNGC2。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

图15. CDs抑制盐渍甘薯幼苗成熟根区的Na⁺吸收。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

图16. CDs改善了缺钾条件下甘薯幼苗根系的生理状态。正值代表离子外排，负值代表离子吸收。

 

其他实验结果

•  丹参衍生的CDs鉴定。该研究首先以丹参（含10 %丹酚酸B）作为碳源，通过水热法合成了CDs，在420nm激发时，在526 nm处有一个最大的发射峰；透射电镜（TEM）图像显示了CDs的球形粒子和良好的单分散性，平均直径为3.32 nm；材料表征数据显示所制备的CDs表面具有丰富的-OH、COOH、-CH和C=O等官能基团。
• CDs触发植物根系膜电位的超极化和Ca²⁺内流。CDs显著诱导植物ROS清除活性，并诱导质膜超极化。
•  CDs衍生物的表征。BA、BrPE和PH分别与小的有机底物(苯酚(-OH)、酮（-C=O）和羧酸化合物（-COOH）发生反应，进一步结果都验证了BA、BrPE和PH处理后CDs上的目标含氧组的成功失活。
• C-OH和COOH官能团有助于CDs的Ca²⁺动员特性。实验进一步研究了甘薯和拟南芥根部对膜电位和Ca²⁺的动员响应；CDs诱导的植物膜电位超极化依赖于CDs上C-OH和COOH官能团；结果表明，CDs处理（40min）显著增强了伸长区GCaMP6特异性荧光，但没有增强dsRED荧光，证实CDs增强甘薯根部的[Ca²⁺]_cyt；然而，在CDs-BA和CDs-BrPE处理的根部，CDs诱导的[Ca²⁺]_cyt增加被显著抑制，这种抑制作用在CDs-PH处理的根部未见抑制作用。
• CDs触发的Ca²⁺动员依赖于cAMP和cGMP的产生和环状核苷酸化离子通道。CDs处理（40 min）显著增强了转基因甘薯根部伸长区cAMPr-和δ-flincg依赖的荧光；进一步用模式植物拟南芥验证，结果表明CDs处理30 min后，dnd1和cngc20突变体根部的红色荧光强度显著低于Col-0，这表明[Ca²⁺]_cyt在这些突变体的根部显著减少。
•  凝集素受体激酶在CDs触发的Ca²⁺动员中发挥重要作用。植物可以感知CDs上的C-OH和COOH官能团，然后激活CNGCs；结果进一步证明了CDs上的C-OH和COOH官能团是激活LORE介导的CDs感知和随后的Ca²⁺动员的分子决定因素；有趣的是，另一个LecRK、LecRK-I.8，拟南芥的细胞外烟酰胺腺嘌呤二核苷酸受体，也在CDs触发的Ca²⁺动员中发挥了重要作用，暗示植物LecRKs可能是CNGCs激活Ca²⁺内流的受体。
• 水培条件下CDs通过增强Ca²⁺信号和Na⁺稳态来提高甘薯植株的耐盐性。盐处理24 h后，甘薯根尖中IbSOS3和IbSOS2的表达水平提高了约1.9-2.0倍；CDs激活CNGCs，增强根尖（伸长区）中[Ca²⁺]_cyt依赖的SOS通路，从而加速Na⁺的外排；在盐（150 mm NaCl）处理12天，CDs处理后根、茎和叶组织中Na⁺的积累分别减少了41%、32%和49%，因此，CDs大大提高了甘薯植株的耐盐性。
• 水培条件下CDs提高了甘薯植株在K⁺和Fe缺乏条件下的适应性。进一步实验表明，CDs加速了甘薯根系对K⁺的吸收，改善了根系的生理状态，并促进了叶片中K⁺的积累和光合作用；Ca²⁺调控的低K⁺应答基因（IbCBL1、IbCBL10和IbHAK5）的表达水平在K⁺缺失24 h后的表达水平显著提高；这些结果表明，Ca²⁺调控的高亲和力K⁺吸收系统参与了CDs刺激的K⁺营养；此外，CDs处理延缓了缺Fe条件下甘薯植株幼叶的黄化，表明甘薯植株对低Fe胁迫的适应性增强；Ca²⁺调控和缺Fe响应基因（IbCBL1、IbFIT、IbIRT1）的表达上调，这进一步增强Fe吸收和稳态；因此，缺铁10天后，CDs处理的幼苗根和叶的Fe含量显著高于对照，因此，CDs处理的幼苗叶绿素含量和光合作用保持在高水平。

 

结论

      生物质衍生碳点（CDs）是农业和环境应用中具有前景的工具。全面了解CDs对植物生理和分子层面的影响对其实际应用至关重要。本研究提供了证据表明CDs上的羟基和羧基能被质膜上的植物LecRKs感知，从而通过激活CNGCs触发Ca²⁺动员。生物质合成的CDs含有丰富的羟基和羧基，具有Ca²⁺动员活性。CDs能够同时动员Ca²⁺并清除ROS，从而增强植物Ca²⁺信号，同时避免ROS迸发引起的氧化损伤，从而使植物对各种环境胁迫具有较强的适应能力。本研究还揭示了水培条件下CDs调节甘薯植物离子稳态（Na⁺、K⁺和Fe²⁺）的可能性。研究结果为利用CDs调控作物的耐盐性、K⁺利用效率和Fe生物强化提供了依据。鉴于Ca²⁺信号参与了植物几乎所有的生理过程，研究结果提出了CDs在不同环境条件下作为特异Ca²⁺信号的放大器或引物的可能性。这种可能性很大程度上拓展了CDs在农业或环境中的应用。

 

 

测试液

0.1mM CaCl₂, 0.5 mM KCl, pH 5.7

1.5mg/mL CDs, 0.1 mM CaCl₂, 0.5 mM KCl, pH 5.7

0.1mMNaCl, 0.1mM MgCl₂, 0.1mM CaCl₂, 0.5mM KCl, pH 5.7

0.5mM KCl, 0.1 mM CaCl2, pH 5.7

 

NMT试验标准化方案

盐胁迫研究NMT标准化方案

 

文章原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c10556?ref=pdf

关键词：碳点；钙动员；环核苷酸门控离子通道；凝集素受体激酶；盐胁迫；缺钾缺铁