中关村旭月非损伤微测技术产业联盟 - PC兰大何凯：NO3-、K+流及膜电位数据为揭示拟南芥SLAH3通过调节N-K平衡参与维持膜电位稳态提供关键支撑

PC兰大何凯：NO₃^-、K⁺流及膜电位数据为揭示拟南芥SLAH3通过调节N-K平衡参与维持膜电位稳态提供关键支撑

基本信息

主题：NO₃^-、K⁺流及膜电位数据为揭示拟南芥SLAH3通过调节N-K平衡参与维持膜电位稳态提供关键支撑

期刊：The Plant Cell

影响因子：12.085

研究使用平台：NMT植物营养创新平台

标题：The anion channel SLAH3 interacts with potassium channels to regulate nitrogen–potassium homeostasis and the membrane potential in Arabidopsis

作者：兰州大学何凯、刘倍贝；首都师范大学冯长鑫

检测离子/分子指标

NO₃^-、K⁺、膜电位

检测样品

5日龄拟南芥根成熟区

中文摘要

氮-钾平衡在植物生长发育过程中至关重要，然而其分子机制尚不清楚。本研究发现，拟南芥中NO₃^-外排通道SLAH3突变导致对高浓度KNO₃的耐受性增强。出乎意料的是，slah3突变体特异地耐受高浓度K⁺，而增加NO₃^-浓度导致野生型和slah3之间表型差异减小。slah3中NO₃^-外流减少，K⁺外流增强，证明SLAH3介导的NO₃^-转运和SLAH3影响的K⁺流动在调控NO₃^--K⁺平衡的过程中至关重要。进一步研究发现，钾离子外排通道GORK/SKOR与SLAH3相互作用。gork/skor突变体在高K⁺条件下表现出超敏感表型。高K⁺处理后，相对于野生型，突变体slah3的去极化减弱，gork/skor的去极化增强，表明NO₃^-/K⁺外排介导的膜电位调控参与了高K⁺响应。电生理结果表明，SLAH3独立于其通道功能抑制GORK/SKOR的活性。该研究首次提出SLAH3对K⁺外排通道的两层调控机制：（1）SLAH3通过膜电位的变化调控电压依赖性K⁺通道；（2）SLAH3与GORK/SKOR相互作用，抑制其通道活性。揭示NO₃^-通道SLAH3与K⁺通道GORK和SKOR形成功能单元，通过协调氮-钾平衡来调节膜电位。

离子/分子流实验处理方法

1/2 MS和添加120 mM K⁺的1/2 MS水培液预处理5 h
膜电位实验处理：120 mM KCl或120 mM KNO₃处理，实时测量

离子/分子流实验结果

（1）在高钾胁迫下SLAH3介导NO₃^-外排

为了进一步验证SLAH3介导的高钾耐受过程与NO₃^-相关，采用NMT检测Col-0和slah3根成熟区NO₃^-的流速。分别在1/2 MS和添加120 mM K⁺的1/2 MS水培液预处理5 h。1/2 MS预处理，slah3-3和slah3-4的NO₃^-外排量明显低于Col-0，这一结果与SLAH3作为NO₃^-外排通道的功能相一致。120 mM K⁺的1/2 MS预处理，Col-0和slah3的NO₃^-外排量显著升高，说明高K⁺诱导了NO₃^-外排。Col-0的NO₃^-外排通量明显高于slah3-3和slah3-4，说明高K⁺诱导的NO₃^-外排需要SLAH3（图1，A和B）。总的来说，在高钾胁迫下SLAH3介导NO₃^-显著外排。

图1 在高钾胁迫下SLAH3介导NO3-外排

（2）K⁺诱导的膜电位去极化在slah3突变体中降低

接下来，探索了SLAH3在高K⁺反应中介导NO₃^-外排的具体意义。阳离子和阴离子在植物细胞膜电位的建立和维持中至关重要。因此，采用NMT穿刺微电极技术研究SLAH3是否通过调节NO₃^-和K⁺平衡来调节膜电位。120 mM KCl和KNO₃处理Col-0和slah3检测根细胞的膜电位的变化。将植株置于1/2 MS液体培养基中，加入120 mM KCl或KNO₃处理。在Col-0中，高浓度的KCl处理会导致膜电位迅速而显著的去极化，而高浓度的KNO₃处理导致较低程度去极化（图2，A和C）。以上结果表明，高浓度K⁺使膜电位去极化，NO₃^-使膜电位复极化。相比之下，KCl对slah3的膜电位去极化作用较小。有趣的是，KNO₃导致slah3的膜电位去极化程度与KCl几乎相同，表明K⁺诱导的去极化在slah3中受损（图2，B和C）。以上结果表明，NO₃^-是调节植物膜电位的重要阴离子，更重要的是，SLAH3通过介导NO₃^-外排在调节膜电位中发挥着重要作用。

图2 K⁺诱导的膜电位去极化在slah3突变体中降低

（3）K⁺诱导的膜电位去极化在gork、skor突变体中增强

在高钾条件下，突变体slah3膜电势与WT相比去极化程度低。接下来探索了钾离子外排通道突变体gork和skor是否也参与膜电势调控过程。在0.5 g L⁻¹ MES（pH 5.8）溶液中使用NMT刺穿微电极检测膜电位，然后在溶液中加入120 mM KNO₃或120 mM KCl处理液记录膜电位的变化。与前期研究结果一致，与KNO₃处理相比KCl在Col-0中引起了更强的去极化（图3 A）。突变体slah3的KCl处理与KNO₃处理结果相似，去极化程度较低（图3，B、C和F）。与WT相比，当高浓度KCl处理时，gork和skor的去极化更强（图3，D、E和F）。这一结果表明钾离子外排通道GORK和SKOR参与了K⁺诱导膜电势调控过程。

图3 K⁺诱导的膜电位去极化在gork、skor突变体中增强

（4）SLAH3在K⁺诱导的NO₃^-和K⁺流出过程发挥重要功能

使用非损伤微测技术分析突变体中NO₃^-和K⁺的净通量。将WT、slah3、gork、skor、gork slah3和skor slah3在添加或不添加120 mM K⁺的1/2 MS液体培养基中预处理5小时后，使用NMT测量NO₃^-和K⁺的净通量。高K⁺预处理的Col-0植株NO₃^-净流出量显著增加。K⁺触发的NO₃^-外排在slah3中显著减少。gork和skor突变体表现出与WT相同的NO₃^-外排，在植物体内证明GORK和SKOR不影响SLAH3的活性。而gork slah3和skor slah3双突变体表现出与slah3相似的NO₃^-外排量（图4 A），这一结果证明在植物高钾胁迫应对过程中SLAH3位于GORK/SKOR的上游。