EEB 中国农科院王耀生团队：NMT发现干旱或/和缺N下保卫细胞钙钾转运特征 为探究胁迫对大麦叶片生理和蛋白质组学的影响提供证据

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基本信息

主题：NMT发现杨树抗旱耐盐基因编辑新种质维持钠/钾/钙/氢离子稳态能力强 为解析其抗逆机制提供了关键依据

期刊：Plant Biotechnology Journal

影响因子：13.8

研究使用平台：NMT植物抗逆创新平台

标题：A breeding strategy for improving drought and salt tolerance of poplar based on CRISPR/Cas9

作者：中国林业科学研究院林业研究所、林木遗传育种全国重点实验室苏晓华、丁昌俊、张腾倩、张伟溪

获奖情况：该成果获得2022-2023年度“中关村优秀NMT成果奖”一等奖

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检测离子/分子指标

Na⁺、K⁺、H⁺、Ca²⁺

 

检测样品

杨树根（距根尖600 µm处根表上的点）

 

供稿人简介

张伟溪，博士，中国林业科学院林业研究所助理研究员，研究方向为林木遗传育种。

 

中文摘要

我国干旱和半干旱地区约占国土面积50%以上，其人工林成活率、保存率低于30%；盐碱地总面积高达9900万hm²，约占全国陆地面积的10.3%，且每年以1.5%的速度增长。随着全球气候变化，国家生态环境建设、碳中和等重大战略实施，迫切需要快速培育逆境适应能力强的林木新品种，实现对干旱、半干旱及盐碱荒地等困难立地的绿化栽培和改良利用，为国土生态安全维护、固碳增汇等提供优良种植材料。本研究以我国北方地区栽植的杨树重要树种84K杨（Populus alba × P. glandulosa）为材料，挖掘出主要在其根部表达的盐和干旱胁迫响应调控因子基因（富含脯氨酸蛋白等位基因PagHyPRP1，PagHyPRP1A和PagHyPRP1B），并利用优化CRISPR/Cas9系统对该基因进行多位点基因组精准编辑。共获得9株PagHyPRP1编辑植株，编辑效率达60%。编辑株系的PagHyPRP1表达水平无论在正常生长还是在盐和干旱胁迫条件下均显著低于野生型84K杨（WT），而过表达株系（OE）的PagHyPRP1表达水平则显著高于野生型，且Paghprp1基因编辑株系在干旱和盐胁迫下的株高、茎径、茎重、根干重和根冠比显著增加，耐盐性和抗旱性显著增强，证明PagHyPRP1基因在杨树响应干旱和盐碱胁迫中的负调控作用。与WT相比，Paghyprp1编辑株系表现出更高的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性以及脯氨酸含量，更低的过氧化氢（H₂O₂）、超氧根离子（O₂-）以及活性氧（ROS）的积累；较高的Na+外排（盐胁迫下）、Ca²⁺内流量（干旱胁迫下）和H⁺内流量，更少的K⁺外排，而OE株系却表现与之相反。表明Paghyprp1基因编辑株系通过提高POD、SOD等抗氧化酶活性、降低ROS、H₂O₂等活性氧的积累、减少细胞的膜质氧化程度、促进根系生长，同时维持根系Na⁺、K⁺、H⁺和Ca²⁺离子平衡，稳定根系渗透平衡，进而提高了植株的抗旱耐盐能力。

 

离子/分子流实验处理方法

45 天苗龄杨树150 mM NaCl胁迫14 d ；20% PEG胁迫7 d。

 

离子/分子流实验结果

为了研究基因编辑杨树在ROS信号传导中对干旱和盐胁迫的反应，测定了根系的关键离子流速和相关基因表达。如图1p，q所示，突变体中RBOHF的低表达产生适当的ROS信号，如H₂O₂，其可以激活各种Ca²⁺通道，并被HPCA1感知以促进细胞外Ca²⁺内流。在干旱模拟胁迫下，Ca²⁺信号可以激活CPK1和其他CPKS，促进Ca²⁺信号转导，并触发对胁迫的转录反应。同时，CPK1的过量表达还可以促进更多的Ca²⁺内流（WT的1.19-1.35倍）。另一方面，编辑株系可能通过上调PMA和AKT的表达来增加H⁺的内流（WT的1.27-1.43倍）和抑制K⁺外排（WT的0.60-0.72倍）。胞内的高离子浓度有利于形成更多的渗透调节物质，降低细胞内的水势，有利于渗透压平衡，进而提高突变体的耐旱性。同样，在盐胁迫下，适当的ROS可能形成“ROS-Ca²⁺”枢纽来激活SOS信号通路（Chen et al.，2021），从而提高SOS1和NHX1的表达，激活Na⁺/H⁺转运蛋白以促进Na⁺外排（WT的1.38-1.59倍）和H⁺内流（WT的1.45-1.70倍）。此外，突变体中AKT1和PMA表达的增加可能限制K⁺流出（是WT的0.63-0.78倍）并增强H质子泵能力，维持细胞内Na⁺/K⁺的平衡，进而增强突变体的耐盐能力。

 

图1 干旱胁迫下各株系Ca²⁺、K²⁺和 H²⁺离子流速。正值代表离子外排，负值代表离子吸收

（a）Ca²⁺离子流；（b）K⁺离子流；（c）H⁺离子流；*，**表示paghyprp1株系和OE株系与WT间差异显著（*P< 0.05，**P < 0.01）；#，##表示paghyprp1株系和WT与OE株系间差异显著（#P< 0.05，## P< 0.01）

 

图2 盐胁迫下各株系Na⁺、K⁺和 H⁺离子流速。正值代表离子外排，负值代表离子吸收

（a）：Na⁺离子流；（b）：K⁺离子流；（c）：H⁺离子流；*，**，#，##同上

 

 

其他实验结果

• 与野生84K相比，编辑株系的PagHyPRP1的表达水平无论在正常生长条件下还是盐和干旱胁迫下均显著降低，过表达OE株系的PagHyPRP1表达水平则相反，证实杨树PagHyPRP1基因在干旱和盐碱胁迫下的负调控作用。
• 共获得9株（5种基因型）PagHyPRP1编辑植株，编辑效率高达60%。
• 在干旱和盐胁迫下，paghprp1编辑株系株高、地径、茎重、根干重和根冠比显著增加，耐盐性和抗旱性显著增强。
• 与WT相比，paghyprp1编辑株系表现出更高SOD、POD活性及脯氨酸含量，更低H₂O₂、O₂-及ROS的积累。

 

结论

该研究首次证实了杨树富含脯氨酸蛋白等位基因PagHyPRP1为盐和干旱胁迫响应负调控因子基因，为林木基因编辑育种提供了重要价值的候选基因；创制出抗旱耐盐性状明显改良的基因编辑杨树，填补了林木特别是世界人工林主栽大树种抗逆基因编辑育种的空白，为应用CRISPR/Cas9等基因组编辑技术创制突破性林木新种质提供实证和技术参考。研究还发现不同突变类型（纯合、等位基因突变、嵌合突变）基因编辑的杨树抗旱耐盐能力均得到有效提高，为针对基因组杂合度高等林木自身特点的基因编辑新策略建立提供新思路。

 

测试液

0.1 mM KCl，0.1 mM CaCl₂，1.0 mM NaCl，pH6.0

 

NMT仪器信息

·活体培养环境监测仪

·智能自动化非损伤微测系统

文章原文：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14147

 

供稿：张伟溪

编辑：叶斌，刘兆义

 

关键词：Ca²⁺；K⁺；H⁺；Na⁺；盐胁迫；干旱胁迫；杨树；根；植物类

 

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