液泡区隔重金属离子的能力/液泡吸重金属离子的速率检测

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经典案例

Plant Physiol Bioch 北京林业大学 陈少良：H2S通过调节胡杨细胞膜和液泡膜的Cd2+转运来缓解Cd2+毒害

 

推荐实验设备

NMT重金属阻控机制分析仪（NMT300-HMP-YG/XY）

 

实验意义

探究耐重金属材料的耐性机制，是否与重金属胁迫下，液泡区隔重金属离子能力强有关。液泡吸收重金属离子的速率越大，代表液泡区隔能力越强。该研究主要以研究茎、叶细胞的液泡为主。

 

检测指标

Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺

 

样品培养及处理

苗龄

苗龄无强制要求。该实验使用苗期样品较多，常见样品苗龄参考：

拟南芥：1~4周

水稻：1~5周

烟草：1~3周

杨树：4~7周

 

培养方式

水培、琼脂培养基、土培、沙培均可，推荐使用水培和琼脂培养，其次是沙培和基质较松散的土培。

 

实验处理

重金属处理24小时。重金属浓度可与您该课题组的其它实验胁迫浓度保持一致。如处理浓度Cd<5μM、Pb<5μM、Cu<50μM，则分别将处理浓度提升至5μM、5μM、50μM。因处理时长较短，建议在此基础上，适当调高胁迫浓度。

 

样品选取

1.植株选取

选取状态良好且外观形态在组内占主流的植株。

2.根、叶片、茎选取

状态良好且外观较为一致。

 

检测流程

前处理

1.在35mm培养皿中滴入一滴测试液，使用镊子将固定样品玻片放置到培养皿中，并压一下玻片使其贴在皿底。

2.吸取100μL液泡悬液，滴入到35mm培养皿中的固定样品玻片中心处，静置10分钟。

3.向培养皿中缓慢加入4mL测试液，再吸出弃去。

4.再次缓慢加入4mL测试液，静置10min。

 

样品前处理视频

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检测过程

1.检测位点：液泡表面

2.检测时长：5-10分钟

3.重复数：n≥8，即每组检测不少于8个液泡。如同一培养皿中有多个液泡符合检测要求，可在同一培养皿中上检测不止1个液泡。

 

耗材清单

指标：Cd²⁺

测试液：xmM CdCl₂, 1.0 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, 500 mM 甘露醇, 0.2 mM HEPES, pH7.0；x=胁迫浓度；重金属化合物与胁迫成分保持一致

指标：Pb²⁺

测试液：xmM Pb(NO₃)₂, 1.0 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, 500 mM 甘露醇, 0.2 mM HEPES, pH7.0；x=胁迫浓度；重金属化合物与胁迫成分保持一致

指标：Cu²⁺

测试液：xmM Cu(NO₃)₂, 1.0 mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, 500 mM 甘露醇, 0.2 mM HEPES, pH7.0；x=胁迫浓度；重金属化合物与胁迫成分保持一致

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检测参数

1.物镜倍数：20倍

2.采样规则：X-10

3.传感器--样品表面距离：2μm

 

参考文献

1. 许越.非损伤微测技术—2022[J].NMT通讯,2023(01):3-9.DOI:10.5281/zenodo.8227586.

2. Sun J, Wang R, Zhang X, et al. Hydrogen sulfide alleviates cadmium toxicity through regulations of cadmium transport across the plasma and vacuolar membranes in Populus euphratica cells. Plant Physiology and Biochemistry 65(0): 67-74. doi: 10.1016/j.plaphy.2013.01.003.

3. Liao Q, Jian S, Song H, et al. Balance between nitrogen use efficiency and cadmium tolerance in Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 2019 Jul;284:57-66. DOI: 10.1016/j.plantsci.2019.04.003.