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4月8日,某研究所将NMT技术应用于钙信号研究,测试样品为小麦,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。| 5月9号,某研究院将NMT技术应用于逆境生理领域,测试样品为黄瓜幼苗,测试指标为NO3-、NH4+,在旭月研究院完成实验。| 6月2号,某研究院将NMT技术应用于逆境胁迫领域,测试样品为棉花苗,测试指标为Ca2+、H+、K+、Na+、IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月5号,某研究院将NMT技术应用于植物逆境领域,测试样品为苜蓿,测试指标为K+,在旭月研究院完成实验。| 6月9号,某研究所将NMT技术应用于水稻逆境领域,测试样品为水稻,测试指标为Na+、Ca2+,在中国科学院植物研究所完成实验。| 6月11号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为酵母细胞,测试指标为IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月16号,某高校将NMT技术应用于昆虫研究,测试样品为昆虫,测试指标为Ca2+、K+,在旭月研究院完成实验。| 6月19号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为拟南芥,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。|

东农王傲雪、陈秀玲:NMT发现病原菌侵染时atpA促叶肉排H+排Ca2+利于植物维持光合作用和信号转导提升抗性


微信原图文

活体叶肉细胞H+、Ca2+跨膜信号测样服务

NMT作为生命科学底层核心技术,是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年,NMT已扎根中国15年。2020年,中国NMT销往瑞士苏黎世大学,正式打开欧洲市场。

感谢本文一作,东北农业大学宫超博士(现任职于广东省农科院蔬菜所)校稿

基本信息

主题:NMT发现病原菌侵染时atpA促叶肉排H+Ca2+利于植物维持光合作用和信号转导提升抗性

期刊:Phytopathology

影响因子:3.234

研究使用平台NMT植物免疫创新平台

标题:Alpha-subunit of the Chloroplast ATP Synthase of Tomato Reinforces the Resistance to Grey Mold and Broad-spectrum Resistance in Transgenic Tobacco

者:东北农业大学王傲雪、陈秀玲、宫超(现任职于广东省农科院蔬菜所)

 

检测离子/分子指标

H+,Ca2+

 

检测样品

WT和转基因烟草叶肉组织

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

叶绿体ATP合成酶(cpATPase)负责光合作用过程中产生ATP。作者前期的研究表明,cpATPase CF1α亚基(AtpA)是参与粉红粘帚霉Clonostachys rosea)诱导番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)抗性的关键蛋白。本研究结果显示番茄cpATPase CF1α亚基基因(atpA)的表达水平被灰霉菌和粉红粘帚霉上调。然后分离番茄atpA基因,并获得转基因烟草株系。与未转化植株相比,过表达atpA的烟草对灰霉菌的抗性增强,表现为病害发生率降低、防御相关超敏反应(hypersensitive response, HR)样反应、活性氧平衡、叶绿体超微结构损伤减轻、ATP含量和cpATPase活性升高、碳代谢、光合作用和防御相关基因表达增强。转基因烟草接种灰霉菌后,Ca2+外排增加,H+外排稳定。此外,atpA基因的过表达增强了对盐分的耐受性和对番茄叶霉病Cladosporium fulvum)抗性。因此,cpATPase的α亚基是介导细胞氧化还原稳态、ATP生物合成和抗性性状基因表达的关键调节因子,在植物产生广谱抗性的过程中调节机体对病原菌的免疫。

 

 

离子/分子流实验处理

以1月龄WT和转基因烟草的第3片成熟叶片为材料,灰霉菌悬浮液侵染0 h、0.5 h和3 h(hpi)

 

 

离子/分子流实验结果

使用非损伤微测技术(NMT)研究烟草叶片(距植株顶部第3个叶片)叶肉细胞Ca2+和H+流速的动态变化。Ca2+在正常条件下表现为轻微外排,WT与转基因烟草植株之间无明显区别。与WT相比,0.5 hpi时转基因烟草的Ca2+外排速率下降较快,而3 hpi时转基因烟草的Ca2+外排速率明显大于WT(图1A, B, C)。在正常生长条件下,WT中H+外排略高于转基因烟草。灰霉菌侵染后,0.5 hpi时转基因植株体内H+外排速率略有增加,但烟草植株间差异不显著。可见,转基因株系的H+外排在整个灰霉菌侵染期间保持稳定,而WT在3 hpi时有明显的下降趋势(图1D, E, F)

图1. 烟草野生型(WT)和转基因株系(OE17和OE30)叶肉细胞对灰霉菌不同时间的实时净Ca2+(A, B, C)和H+(D, E, F)流速响应。注:(A, D)用缓冲液(模拟接种处理)处理烟株,(B, E)用灰霉病菌处理0.5 hpi,(C, F)用灰霉病菌处理3 hpi。

图2. 叶肉细胞检测图

 

 

其他实验结果

  • atpA cDNA全长1524 bp,与叶绿体基因组序列相比,有一个单核苷酸突变(T674→C674)。

  • 通过卡那霉素筛选培养基、PCR和qRT-PCR方法筛选出atpA表达量较高的3个atpA过表达株系,分别是OE17、OE21和OE30。

  • 灰霉菌处理的WT烟草植株在7 dpi时症状严重,有明显的病斑,转基因烟草叶片伤口部位周围无明显症状或褐变范围较小。30 dpi时,WT叶片黄化枯萎,而OE17、OE21和OE30叶片的坏死面积均小于野生型,表明OE17、OE21和OE30叶片的坏死面积受atpA过表达的控制。

  • 与WT相比,所有atpA过表达烟草的灰霉病症状均显著降低。过表达atpA显著降低了灰霉菌侵染烟草植株的病情指数和发病率。

  • atpA过表达稳定了灰霉菌侵染下的叶绿体结构。

  • 12~48 hpi期间,OE17、OE21、OE30的叶绿素a和叶绿素b含量均高于WT。

  • CAT活性在所有烟草植物的3 hpi之前增加,OE17、OE21和OE30的CAT活性超过WT;转基因株系的SOD在24、48和96 hpi时高于WT;在所有烟草中,POD活性先是下降,但到96 hpi时又上升,转基因系的POD活性在96 hpi达到最大值;3种转基因株系的苯丙氨酸酶(PAL)活性在6和96 hpi时显著提高。

  • 转基因株系在全株侵染期间F1F0-ATPase活性高于WT。

  • 转基因株系与WT之间H2O2含量在3 hpi时差异最大;转基因株系的NO水平和O2-水平始终高于WT。

  • 植物在真菌侵染的不同阶段已经进化出一系列的防御机制,而灰霉菌侵染可导致atpA介导的许多代谢途径的改变。

  • 转基因烟草在盐胁迫下表现出明显优于WT的种子发芽率和幼苗生长。此外,对WT和转基因烟草植株喷洒孢子悬浮液,发现转基因烟草对番茄叶霉病的抗性增加。

 

 

结论

本研究结果表明,与野生型烟草相比,过表达atpA正调节植物对灰霉菌的抗性,这是由ROS的平衡、氧化损伤减少和光合作用效率提高所推断的。在病原菌感染初期,过表达关键atpA基因可以调控植物—病原物互作相关基因以及光合相关和代谢相关基因的表达。此外,atpA过表达同时提高了植物的耐盐性和对番茄叶霉病抗性,表明其具有诱导广谱防御的能力。

 

 

测试液

NH4+2.5 mM CaCl2, 1.5mM K2SO4, 0.6 mM Na2HPO4, 0.25 mM MgSO4, 4 mM (NH4)2SO4, pH 4.0

NO3-2.5 mM CaCl2, 1.5mM K2SO4, 0.6 mM Na2HPO4, 0.25 mM MgSO4, 8 mM NaNO3, pH 4.0

 

 

仪器采购信息

  • 据中关村NMT产业联盟了解,东北农业大学于2018年采购了美国扬格公司的非损伤微测系统。

 

文章原文:http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-06-20-0242-R

 

2019版《NMT论文集》已出版

 

关键词:cpATPase α亚基;ATP;番茄;广谱抗性;灰霉菌抗性