用离子流技术和荧光蛋白提高胞内外Ca²⁺和H⁺的时空分辨率

图注：通过pHluorin染色的花粉管尖端胞内的H+浓度和应用非损伤微测技术测定烟草花粉管尖端的H+流。正值为外流，负值为内流。

Ca²⁺和H⁺在花粉管生长、定向伸长及形态形成方面起重要作用，花粉管中分化细胞的伸长需要Ca²⁺和H⁺的浓度梯度的存在。由于百合不易构建稳定的转基因体系，因此并不适合作为分子遗传研究的模式植物，而烟草转基因及细胞生物学方面的研究较为深入，其花粉管也便于获得，因此更适合作为花粉管研究的模式材料。

葡萄牙科学家Feijó和Michard等研究人员用烟草作为实验材料，瞬时表达了pHluorin和黄色Cameleon蛋白作为探针分别用于胞内H⁺和Ca²⁺的比例成像分析，H⁺和Ca²⁺离子流通过非损伤微测技术流获得，并应用傅立叶分解法及连续小波分析法分析花粉管伸长期间离子浓度梯度、离子流及生长速率。结果表明，烟草花粉管尖端存在一个0.4pH单位的梯度，而且花粉管上存在一个亚尖端的碱化区域。胞外质子流振荡大约在10～40pmol·cm^-2·s^-1，花粉管胞内及胞内H⁺振荡存在一个或两个峰，Ca²⁺在花粉管尖端存在一个0.2～1.0uM的离子浓度梯度，振荡周期为1～4min，胞外的Ca²⁺流振荡大约在2～50pmol·cm^-2·s^-1。共聚焦及宽谱显微观察表明，花粉管细胞内的H⁺和Ca²⁺的模式和形状有所差异。

这项研究应用非损伤微测技术和荧光指示蛋白使花粉管H⁺和Ca²⁺的研究精度得以提高，是分子生物学手段与生理检测手段结合研究花粉管的一个范例。

关键词：花粉管(Pollen tube)，钙信号(Calcium signaling)，质子信号(Proton signaling)，细胞分化(Cell polarization)

参考文献：Erwan Michard. et al. Sexual Plant Reproduction, 2008, 21: 169-181

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